employee from 01.01.1992 to 01.01.2025
Moscow, Russian Federation
Moscow, Moscow, Russian Federation
Moscow, Russian Federation
The paper presents new data on the state of the problem of gluten intolerance. Data on the effectiveness of the biocatalytic effect on allergenic proteins of grain raw materials are given. The results of studies of the activities of hydrolytic enzyme preparations for the destruction of high-protein polymers-allergens of grain raw materials were obtained. The fractional composition of samples of grain raw materials and their hydrolysates was studied and it was found that the selected enzymes obtained on the basis of the filamentous fungus Aspergillus oryzae, and the enzyme system consisting of enzyme preparations obtained on the basis of filamentous fungi Aspergillus oryzae and Aspergillus niger, makes it possible to effectively modify allergenic fractions to low molecular weight peptides and amino acids. A decrease in the level of molecular masses of hydrolysates from 97 to 30–25 kDa was revealed. The composition of free amino acids in the obtained hydrolysates was studied and it was found that, as a result of enzymatic lysis, there is a significant increase (from 2.5 to 9 times) in such amino acids as serine, glutamine, glycine and proline. A comparative evaluation of the action of the enzyme preparation Amyloprotoorisin and an enzyme system containing enzymes of amylolytic and proteolytic action was carried out, and it was found that the presented enzyme preparations can be used to obtain low molecular weight wheat hydrolysates. These hydrolysates will be used to formulate gluten-free products.
enzyme lysate, gluten, allergenic fractions, amino acids, enzymes, molecular weight, peptidase, wheat, gluten-free products
Введение. В последнее время распространенность целиакии приобретает значительные масштабы. Это одно из немногих наследственных заболеваний, которое значительно снижает качество жизни. Для снижения рецидивов и увеличения длительности ремиссии разработка программ диагностики и назначение безглютеновой диеты крайне актуально [1]. Значимость рационов безглютенового питания с составленными рецептурами необходимо законодательно утвердить, поскольку от этого зависит здоровье и качество жизни больных целиакией [2, 3].
В литературе имеется множество публикаций по модификации глютена, приводящей к снижению его аллергенных свойств [4–6]. Есть сведения по снижению аллергенности до низкомолекулярных пептидов и аминокислот растительными, животными, микробными пептидазами [7–12]. Применение пептидаз из пророщенного зерна, пепсина или трипсина, микробных пептидаз на основе Aspergillus, молочнокислых бактерий имеет возможность получения низкоглютеновых продуктов с содержанием глютена от 20 до 100 мг/кг [13–15].
Грибы рода Aspergillus – чрезвычайно разнообразная и метаболически гибкая группа микромицетов. У семи различных видов рода Aspergillus (A. nidulans, A. niger, A. oryzae, A. terreus, A. flavus, N. fischeri и A. fumigatus) идентифицированы 133 возможные пептидазы [16]. По результатам сравнения геномов в грибах рода Aspergillus составляют гены, кодирующие сериновые пептидазы. Проведенные исследования биокаталитических активностей ферментов подтверждают эти результаты, так как сериновые пептидазы действительно представляют наиболее крупный класс протеолитических ферментов [17, 18].
Среди пептидаз грибного происхождения пептидаза из Aspergillus niger (AN-PEP) очень эффективно разрушает белки и пептиды глютена [16–18]. Представленный фермент оптимально работает при нейтральном рН, остается стабильным при кислом и полностью устойчив к перевариванию пепсином. Он разрушает неповрежденные белки глютена, а также стимулирующие Т-клетки пептиды гораздо быстрее, чем микробные пептидазы на основе бактериальных культур. Еще одним преимуществом является то, что некоторые штаммы рода Aspergillus являются непатогенными, и ферменты на их основе могут быть произведены с невысокими затратами в промышленных условиях. Также известно, что пептидазы из Aspergillus oryzae (в основном дипептидилпептидаза IV) способны детоксифицировать достаточное количество глютена [19, 20].
Но очевидно, что до сих пор существует актуальность разработки новых методик снижения глютеновых фрагментов и получения продуктов на их основе. Одним из эффективных методов является метод биокаталитической деградации глютена [21–23].
Цель исследования – изучение возможностей использования протеиназ грибного происхождения для блокирования механизмов возникновения и развития целиакии путем гидролиза глютеновых белков, являющихся основой развития данного заболевания.
Объекты и методы. В качестве объектов исследований были использованы мука и экструдат пшеницы из цельнозерновой муки. Для проведения гидролиза муки и экструдата были использованы ферментные препараты: КФПА (комплексный ферментный препарат Амилопротооризин) и ферментные препараты, содержащие ферменты амилолитического и протеолитического действия. Уровень протеолитической активности анализировали по степени гидролиза гемоглобина [24], амилолитической и глюкоамилазной – по степени гидролиза крахмала [25], ксиланазной – по степени гидролиза ксилана [26], целлюлазной – по степени гидролиза карбоксиметилцеллюлозы [27]. Cостав и концентрацию свободных аминокислот определяли на высокоэффективном жидкостном хроматографе фирмы KNAUER (Германия) [28].
Процесс гидролиза высокомолекулярных полимеров белковых веществ осуществляли ФП в подобранных ранее условиях: в течение 2 ч при 50 °С, при рН 5,5 [14], гидромодуль суспензии 1:2. Для исследования белковых фракций ферментолизатов и исходного сырья использовали метод ДДС-электрофореза в полиакриламидном геле [29]. Статистическую обработку экспериментальных данных проводили методом однофакторного дисперсионного анализа с помощью компьютерной программы Excel.
Результаты и их обсуждение. Как известно, для гидролиза пшеницы необходимо осуществить подбор ферментов или ферментных систем для максимальной деструкции высокомолекулярных белков до низкомолекулярных пептидов и свободных аминокислот.
На первом этапе исследований изучали состав ферментов, входящих в состав ферментного комплекса.
В таблице 1 в качестве ферментов для гидролиза глютена использовали ферментные препараты протеолитического и амилолитического действия (ФС), включающие ферментные препараты: ФП Flavourzyme, содержащий две аминопептидазы, две дипептидилпептидазы, три эндопептидазы; ФП Neutrase, содержащий нейтральную протеазу; ФП Fyngamyl, содержащий альфа-амилазу производства компании Novozymes. В качестве сравнения с импортными аналогами использовали ферментный препарат отечественного производства КФПА, содержащий в своем составе ферменты аминопептидазу, эндопептидазу, нейтральную протеазу и альфа-амилазу для гидролиза белковых и крахмалистых веществ зернового сырья.
Далее исследовали ФП КФПА и комплекс ферментов Flavourzyme + Neutrase + Fyngamyl на степень гидролиза полимеров белковых веществ. Для этого был проведен электрофорез в ПААГ с маркером от 14,4 до 97,4 кДа. Объектами служили прогидролизованные цельнозерновая пшеничная мука и экструдат,полученный на основе этой муки.
Таблица 1
Характеристика используемых ферментных препаратов
|
Ферментный препарат |
Продуцент |
Состав ферментного комплекса,ед/г (ед/см3) |
||||
|
ПС |
АС |
ГлС |
КС |
ЦС |
||
|
КФПА (комплексный ферментный препарат Амилопротооризин) |
Aspergillus oryzae |
600+29,5 |
800+39,5 |
0 |
50+2,3 |
0 |
|
Протоферм FP |
Aspergillus niger |
900+43,0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
Flavourzyme |
Aspergillus oryzae |
500+22,8 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
Брюзайм |
Aspergillus niger |
0 |
0 |
0 |
1000+48,5 |
1100+52,3 |
|
Термамил |
Bacillus subtiliis |
0 |
900+45,0 |
200+10,5 |
0 |
0 |
|
кДа
97,4 75,0 50,0
37,0 31,0 20,0
14,4
|
ДДС-электрофорез исследуемых гидролизатов:
М – маркер; 1 – мука пшеничная (контроль); 2 – экструдат муки (контроль);
3 – мука пшеничная + КФПА; 4 – экструдат муки + КФПА
5 – мука пшеничная + ФС; 6 – экструдат муки + ФС
На ДДС-электрофореграмме показана возможность применения ферментов для гидролиза муки и экструдата (см. рис.). Результаты подтверждают, что использование ФП КФПА и ФС, содержащей протеазу, эндопептидазу и альфа-амилазу, эффективно для гидролиза аллергенных высокомолекулярных белков.
Аминокислотный состав белков пшеницы (глиадина и глютена) придает определенные свойства ферментолизату на основе данного вида сырья. По литературным данным известно, что ферментный гидролиз «разрывает» связи между аминокислотами так, что в конце аминокислотной цепочки остается глутаминовая кислота.
Кроме глутаминовой кислоты белок клейковины пшеницы содержит в большем количестве пролин, серин и глицин. Результаты электрофореза демонстративно свидетельствуют о снижении в процессе гидролиза молекулярной массы белков, что говорит о наличии в составе ферментолизатов аминокислот и низкомолекулярных пептидов.
Поэтому полученные ферментолизаты пшеницы исследовали на состав свободных аминокислот (табл. 2).
Таблица 2
Состав свободных аминокислот гидролизатов пшеницы
|
Аминокислота, г/100 г образца |
Образец 1 (пшеница без ФП) |
Образец 2 (гидролизат с КФПА) |
Образец 3 (гидролизат с ФС) |
|
Аспарагин |
0,168 |
0,190 |
0,187 |
|
Треонин |
0,272 |
0,660 |
0,559 |
|
Серин |
0,057 |
0,350 |
0,288 |
|
Глутаминовая кислота |
0,141 |
0,370 |
0,390 |
|
Пролин |
0,044 |
0,380 |
0,395 |
|
Глицин |
0,022 |
0,080 |
0,077 |
|
Аланин |
0,027 |
0,160 |
0,240 |
|
Цистеин |
– |
– |
– |
|
Валин |
0,340 |
0,420 |
0,410 |
|
Метионин |
0,190 |
0,270 |
0,284 |
|
Изолейцин |
0,094 |
0,240 |
0,233 |
|
Лейцин |
0,380 |
0,620 |
0,590 |
|
Тирозин |
– |
0,100 |
0,099 |
|
Фенилаланин |
– |
0,300 |
0,287 |
|
Гистидин |
0,304 |
0,890 |
0,778 |
|
Лизин |
0,063 |
0,150 |
0,142 |
|
Триптофан |
0,290 |
0,580 |
0,520 |
|
Аргинин |
– |
– |
0,010 |
|
Всего |
2,392 |
5,760 |
5,489 |
Анализ аминокислотного состава показал увеличение в процессе гидролиза свободных аминокислот – глутаминовой кислоты, серина, пролина и глицина от 2,5 до 9,0 раза соответственно по сравнению с контрольным вариантом.
Заключение. В результате проведенных исследований была показана возможность применения ферментного препарата КФПА и ферментной системы с тем же комплексом ферментов на степень гидролиза высокомолекулярных белков клейковины. Результаты экспериментов демонстрируют использование ФП КФПА и ферментной системы, что подтверждено материалами исследований. Также увеличение в процессе гидролиза показателей свободных аминокислот играет ключевую роль при составлении рецептур сбалансированных безглютеновых продуктов за счет повышенной усвояемости низкомолекулярных белков.
1. Natural history of celiac disease autoimmunity in a USA cohort followed since 1974 / C. Catas¬si [et al.] // Ann. Med. 2010.Vol. 42. P. 530–538.
2. Komplaentnost' k bezglyutenovoy diete u detey pri celiakii / D.S. Fugol' [i dr.] // Russkiy medicinskiy zhurnal: 2013. № 24. S. 1206–1210.
3. Non-celiac gluten sensitivity: a work-in-progress entity in the spectrum of wheat-related disorders / U. Volta [et al.] // Best Pract Res Clin Gastroenterol. 2015 Jun. 29(3). P. 477–491.
4. Skin tests with native, depigmented and glutaraldehyde polymerized allergen extracts / M. Casanovas [et al.] // J. Invest. Allergol. Clin. Immunol. 2005. Vol. 15 (1). P. 30–36.
5. Mechanisms of immune suppression by interleukin-10 and transforming growth factor-p: the role of T regulatory cells / A. Taylor [et al.] // Immunology. 2006. Vol. 117. Issue 4. P. 433.
6. Mechanisms of allergen specific immune-therapy – T-cell tolerance and more / M. Jutel [et al.] // Allergy. 2006. Vol. 61. N 7. P. 796–807.
7. Poluchenie fermentativnyh gidrolizatov belkov molochnoy syvorotki s ispol'zo-vaniem proteoliticheskih fermentov / A.Yu. Prosekov [i dr.] // Fundamental'nye issledovaniya. 2013. № 6. S. 1089–1093.
8. Ekstruzionnaya tehnologiya pererabotki risovoy muki i deglyutenizirovannogo gidrolizata pshenicy v tehnologii bezglyutenovyh snekov / M.V. Amelyakina [i dr.] // Mat-ly pula nauch.-prakt. konf. Kerch', 2022. S. 89–92.
9. Biodestrukciya belkov zernovogo syr'ya dlya polucheniya novyh hlebobulochnyh izdeliy / L.V. Rimareva [i dr.] // Voprosy pitaniya. 2018. T. 87. № 6. S. 67–75.
10. Varrett A.J. Proteolytic enzymes: serine and cysteine peptidases // Methods Enzymol. 1994. Vol. 244. N 1. P. 1–15.
11. A genomic survey of proteases in Aspergillus / S.O. Budak [et al.] // BMC Genomics. 2014. Vol. 15: 523.
12. Sequencing and functional annotation of the whole genome of the filamentous fungus Aspergillus westerdijkiae / X. Han [et al.] // BMC Genomics. 2016. Vol. 17: 633.
13. Sedolisins, a new class of secreted proteases from Aspergillus fumigatus with endoprotease or tripeptidyl-peptidase activity at acidic pHs / U. Reichard [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. 2006. Vol. 72. № 3. P. 1739–1748.
14. Production and partial characterization of serine and metallo peptidases secreted by Asper¬gillus fumigatus Fresenius in submerged and solid state fermentation / R.R. Da Silva [et al.] // Braz. J. Microbiol. 2013. Vol. 44. № 1. P. 235–243.
15. Yahyaeva M.A., Ahmedova Z.R. Nekotorye svoystva proteoliticheskih fermentov griba Aspergillus oryzae-5 // Universum: tehnicheskie nauki. 2020. № 9 (78). URL: https://7universum.com/ru/tech/archive/item/10730 (data obrascheniya: 28.04.2022).
16. Merkur'eva G.Yu., Kamaeva S.S., Shayhullina L.F. Sravnitel'naya harakteristika fermentnyh preparatov s pischevaritel'noy aktivnost'yu // Mezhdunarodnyy zhurnal prikladnyh i fundamental'nyh issledovaniy. 2022. № 2. S. 5–10.
17. Shestakova E.A., Galstyan G.R. Ingibitory dipeptidilpeptidazy-4: sravnitel'nyy analiz predstaviteley gruppy // Problemy endokrinologii. 2012. № 1. S. 61–66.
18. Process biosinteza lizina shtammom Cory-nebacterium glutamicum B-11167 na osnove sred, soderzhaschih gidrolizat pshenichnogo glyutena / A.A. Sirotin [i dr.] // Sovremennye problemy nauki i obrazovaniya. 2012. № 6. S. 38–39.
19. Esposito K., Cozzolino D., Bellastella G. et al. Dipeptidyl peptidase-4 inhibitors and HbA1c target of 4. Craddy P., Palin H-J., Johnson K.I. Comparative Effectiveness of Dipeptidylpepti-dase-4 Inhibitors in Type 2 Diabetes: A Systematic Review and Mixed Treatment Comparison. DiabetesTher., Jun., 2014, 5(1). P. 1–41.
20. Krentz A.J., Patel M.B., Bailey C.J. New drugs for type 2 diabetes mellitus: what is their place in therapy? Drugs, 2008, 68 (15). P. 2131–2162.
21. Razrabotka koncepcii proizvodstva snekov iz pshenicy s eliminaciey glyutena biokataliticheskim metodom / A.Yu. Sharikov [i dr.] // Vestnik VGUIT. 2020. T. 82, № 4. S. 77–83.
22. Bavykina I.A., Popov V.I., Zvyagin A.A. Bezglyutenovaya dieta v terapii vnekishechnyh form neperenosimosti glyutena // Voprosy pitaniya. 2020. T. 89, № 2. S. 21–25.
23. Snizhenie allergennyh svoystv belkov moloka. Tehnologicheskie podhody / V.P. Kurchenko [i dr.] // Molochnaya promyshlennost'. 2012. № 4. S. 73–75.
24. GOST 34430-2018. Fermentnye preparaty dlya pischevoy promyshlennosti. Metody opredeleniya proteoliticheskoy aktivnosti. M., 2018.
25. GOST 34440-2018. Fermentnye preparaty dlya pischevoy promyshlennosti. Metody opredeleniya amiloliticheskoy aktivnosti. M., 2018.
26. GOST R 55302-2012. Fermentnye preparaty dlya pischevoy promyshlennosti. Metody opredeleniya ksilanaznoy aktivnosti. M., 2012.
27. GOST R 55293-2012. Fermentnye preparaty dlya pischevoy promyshlennosti. Metody opredeleniya cellyulaznoy aktivnosti. M., 2012.
28. Shleykin A.G., Skvorcova N.N., Blandov A.N. Biohimiya. Laboratornyy praktikum. Ch. 2. Belki. Fermenty. Vitaminy: ucheb. posobie. SPb.: Un-t ITMO, 2015. 106 s.
29. Struchkova I.V., Kal'yasova E.A. Teoreticheskie i prakticheskie osnovy provedeniya elektroforeza belkov v poliakrilamidnom gele. N. Novgorod, 2012. 60 s.
