Введение. В последнее время распространенность целиакии приобретает значительные масштабы. Это одно из немногих наследственных заболеваний, которое значительно снижает качество жизни. Для снижения рецидивов и увеличения длительности ремиссии разработка программ диагностики и назначение безглютеновой диеты крайне актуально [1]. Значимость рационов безглютенового питания с составленными рецептурами необходимо законодательно утвердить, поскольку от этого зависит здоровье и качество жизни больных целиакией [2, 3].В литературе имеется множество публикаций по модификации глютена, приводящей к снижению его аллергенных свойств [4–6]. Есть сведения по снижению аллергенности до низкомолекулярных пептидов и аминокислот растительными, животными, микробными пептидазами [7–12]. Применение пептидаз из пророщенного зерна, пепсина или трипсина, микробных пептидаз на основе Aspergillus, молочнокислых бактерий имеет возможность получения низкоглютеновых продуктов с содержанием глютена от 20 до 100 мг/кг [13–15].Грибы рода Aspergillus – чрезвычайно разнообразная и метаболически гибкая группа микромицетов. У семи различных видов рода Asper­gillus (A. nidulans, A. niger, A. oryzae, A. terreus, A. flavus, N. fischeri и A. fumigatus) идентифицированы 133 возможные пептидазы [16]. По результатам сравнения геномов в грибах рода Aspergillus составляют гены, кодирующие сериновые пептидазы. Проведенные исследования биокаталитических активностей ферментов подтверждают эти результаты, так как сериновые пептидазы действительно представляют наиболее крупный класс протеолитических ферментов [17, 18].Среди пептидаз грибного происхождения пептидаза из Aspergillus niger (AN-PEP) очень эффективно разрушает белки и пептиды глютена [16–18]. Представленный фермент оптимально работает при нейтральном рН, остается стабильным при кислом и полностью устойчив к перевариванию пепсином. Он разрушает неповрежденные белки глютена, а также стимулирующие Т-клетки пептиды гораздо быстрее, чем микробные пептидазы на основе бактериальных культур. Еще одним преимуществом является то, что некоторые штаммы рода Aspergillus являются непатогенными, и ферменты на их основе могут быть произведены с невысокими затратами в промышленных условиях. Также известно, что пептидазы из Aspergillus oryzae (в основном дипептидилпептидаза IV) способны детоксифицировать достаточное количество глютена [19, 20].Но очевидно, что до сих пор существует актуальность разработки новых методик снижения глютеновых фрагментов и получения продуктов на их основе. Одним из эффективных методов является метод биокаталитической деградации глютена [21–23].Цель исследования – изучение возможностей использования протеиназ грибного происхождения для блокирования механизмов возникновения и развития целиакии путем гидролиза глютеновых белков, являющихся основой развития данного заболевания.Объекты и методы. В качестве объектов исследований были использованы мука и экструдат пшеницы из цельнозерновой муки. Для проведения гидролиза муки и экструдата были использованы ферментные препараты: КФПА (комплексный ферментный препарат Амилопротооризин) и ферментные препараты, содержащие ферменты амилолитического и протеолитического действия. Уровень протеолитической активности анализировали по степени гидролиза гемоглобина [24], амилолитической и глюкоамилазной – по степени гидролиза крахмала [25], ксиланазной – по степени гидролиза ксилана [26], целлюлазной – по степени гидролиза карбоксиметилцеллюлозы [27]. Cостав и концентрацию свободных аминокислот определяли на высокоэффективном жидкостном хроматографе фирмы KNAUER (Германия) [28].Процесс гидролиза высокомолекулярных полимеров белковых веществ осуществляли ФП в подобранных ранее условиях: в течение 2 ч при 50 °С, при рН 5,5 [14], гидромодуль суспензии 1:2. Для исследования белковых фракций ферментолизатов и исходного сырья использовали метод ДДС-электрофореза в полиакриламидном геле [29]. Статистическую обработку экспериментальных данных проводили методом однофакторного дисперсионного анализа с помощью компьютерной программы Excel.Результаты и их обсуждение. Как известно, для гидролиза пшеницы необходимо осуществить подбор ферментов или ферментных систем для максимальной деструкции высокомолекулярных белков до низкомолекулярных пептидов и свободных аминокислот.На первом этапе исследований изучали состав ферментов, входящих в состав ферментного комплекса.В таблице 1 в качестве ферментов для гидролиза глютена использовали ферментные препараты протеолитического и амилолитического действия (ФС), включающие ферментные препараты: ФП Flavourzyme, содержащий две аминопептидазы, две дипептидилпептидазы, три эндопептидазы; ФП Neutrase, содержащий нейтральную протеазу; ФП Fyngamyl, содержащий альфа-амилазу производства компании Novozymes. В качестве сравнения с импортными аналогами использовали ферментный препарат отечественного производства КФПА, содержащий в своем составе ферменты аминопептидазу, эндопептидазу, нейтральную протеазу и альфа-амилазу для гидролиза белковых и крахмалистых веществ зернового сырья.Далее исследовали ФП КФПА и комплекс ферментов Flavourzyme + Neutrase + Fyngamyl на степень гидролиза полимеров белковых веществ. Для этого был проведен электрофорез в ПААГ с маркером от 14,4 до 97,4 кДа. Объектами служили прогидролизованные цельнозерновая пшеничная мука и экструдат,полученный на основе этой муки. Таблица 1Характеристика используемых ферментных препаратов Ферментный препаратПродуцентСостав ферментного комплекса,ед/г (ед/см3)ПСАСГлСКСЦСКФПА (комплексныйферментный препаратАмилопротооризин)Aspergillus oryzae600+29,5800+39,5050+2,30Протоферм FPAspergillus niger900+43,00000FlavourzymeAspergillus oryzae500+22,80000БрюзаймAspergillus niger0001000+48,51100+52,3ТермамилBacillus subtiliis0900+45,0200+10,500  кДа   97,475,050,0 37,031,020,0  14,4    ДДС-электрофорез исследуемых гидролизатов:М – маркер; 1 – мука пшеничная (контроль); 2 – экструдат муки (контроль);3 – мука пшеничная + КФПА; 4 – экструдат муки + КФПА5 – мука пшеничная + ФС; 6 – экструдат муки + ФС  На ДДС-электрофореграмме показана возможность применения ферментов для гидролиза муки и экструдата (см. рис.). Результаты подтверждают, что использование ФП КФПА и ФС, содержащей протеазу, эндопептидазу и альфа-амилазу, эффективно для гидролиза аллергенных высокомолекулярных белков. Аминокислотный состав белков пшеницы (глиадина и глютена) придает определенные свойства ферментолизату на основе данного вида сырья. По литературным данным известно, что ферментный гидролиз «разрывает» связи между аминокислотами так, что в конце аминокислотной цепочки остается глутаминовая кислота.Кроме глутаминовой кислоты белок клейковины пшеницы содержит в большем количестве пролин, серин и глицин. Результаты электрофореза демонстративно свидетельствуют о снижении в процессе гидролиза молекулярной массы белков, что говорит о наличии в составе ферментолизатов аминокислот и низкомолекулярных пептидов.Поэтому полученные ферментолизаты пшеницы исследовали на состав свободных аминокислот (табл. 2).  Таблица 2 Состав свободных аминокислот гидролизатов пшеницы Аминокислота,г/100 г образцаОбразец 1 (пшеница без ФП)Образец 2 (гидролизат с КФПА)Образец 3 (гидролизат с ФС)Аспарагин0,1680,1900,187Треонин0,2720,6600,559Серин0,0570,3500,288Глутаминовая кислота0,1410,3700,390Пролин0,0440,3800,395Глицин0,0220,0800,077Аланин0,0270,1600,240Цистеин–––Валин0,3400,4200,410Метионин0,1900,2700,284Изолейцин0,0940,2400,233Лейцин0,3800,6200,590Тирозин–0,1000,099Фенилаланин–0,3000,287Гистидин0,3040,8900,778Лизин0,0630,1500,142Триптофан0,2900,5800,520Аргинин––0,010Всего2,3925,7605,489  Анализ аминокислотного состава показал увеличение в процессе гидролиза свободных аминокислот – глутаминовой кислоты, серина, пролина и глицина от 2,5 до 9,0 раза соответственно по сравнению с контрольным вариантом.Заключение. В результате проведенных исследований была показана возможность применения ферментного препарата КФПА и ферментной системы с тем же комплексом ферментов на степень гидролиза высокомолекулярных белков клейковины. Результаты экспериментов демонстрируют использование ФП КФПА и ферментной системы, что подтверждено материалами исследований. Также увеличение в процессе гидролиза показателей свободных аминокислот играет ключевую роль при составлении рецептур сбалансированных безглютеновых продуктов за счет повышенной усвояемости низкомолекулярных белков.