Краснодарский научно-исследовательский институт хранения и переработки сельскохозяйственной продукции – филиал ФГБНУ «Северо-Кавказский федеральный научный центр садоводства, виноградарства, виноделия» (старший научный сотрудник)
Краснодарский научно-исследовательский институт хранения и переработки сельскохозяйственной продукции – филиал ФГБНУ «Северо-Кавказский федеральный научный центр садоводства, виноградарства, виноделия» (отдел пищевых технологий, контроля качества и стандартизации, старший научный сотрудник)
Краснодарский научно-исследовательский институт хранения и переработки сельскохозяйственной продукции – филиал ФГБНУ «Северо-Кавказский федеральный научный центр садоводства, виноградарства, виноделия» (отдел пищевых технологий, контроля качества и стандартизации, старший научный сотрудник)
Краснодар, Краснодарский край, Россия
сотрудник
сотрудник с 01.01.2024 по настоящее время
Краснодар, Краснодарский край, Россия
сотрудник
Краснодар, Краснодарский край, Россия
Краснодарский научно-исследовательский институт хранения и переработки сельскохозяйственной продукции – филиал ФГБНУ «Северо-Кавказский федеральный научный центр садоводства, виноградарства, виноделия» (отдел пищевых технологий, контроля качества и стандартизации, главный научный сотрудник)
Краснодар, Краснодарский край, Россия
ВАК 4.1.1 Общее земледелие и растениеводство
ВАК 4.1.2 Селекция, семеноводство и биотехнология растений
ВАК 4.1.3 Агрохимия, агропочвоведение
ВАК 4.1.4 Садоводство, овощеводство, виноградарство и лекарственные культуры
ВАК 4.1.5 Мелиорация, водное хозяйство и агрофизика
ВАК 4.2.1 Патология животных, морфология, физиология, фармакология и токсикология
ВАК 4.2.2 Санитария, гигиена, экология, ветеринарно-санитарная экспертиза и биобезопасность
ВАК 4.2.3 Инфекционные болезни и иммунология животных
ВАК 4.2.4 Частная зоотехния, кормление, технологии приготовления кормов и производства продукции животноводства
ВАК 4.2.5 Разведение, селекция, генетика и биотехнология животных
ВАК 4.3.5 Биотехнология продуктов питания и биологически активных веществ
УДК 665.372 Лицитин
ГРНТИ 65.65 Масложировая промышленность
Цель исследований – разработка технологии получения пищевых добавок – гидролизованных жидких лецитинов с заданным содержанием лизофосфолипидов. Объекты исследований – гидролизованные жидкие лецитины, полученные в результате частичного ферментативного гидролиза фосфолипидов, содержащихся в подсолнечном обезжиренном лецитине. Гидролиз осуществляли в лабораторных условиях с помощью ферментного препарата ROHALASE PL-XTRA, содержащего фосфолипазу А2 микробного происхождения. Реакционную среду для гидролиза готовили путем смешивания обезжиренного лецитина и дистиллированной воды, предварительно нагретой до 50 °С, в соотношении 1 : 4 (по массе), внесения буферного раствора для получения заданного значения рН среды и ферментного препарата в дозировке, рассчитанной с учетом содержания фосфолипидов в лецитине и активности фермента. Процесс гидролиза осуществляли при постоянном перемешивании и поддержании температуры на заданном уровне. Эффективность гидролиза оценивали по степени конверсии субстрата, т. е. фосфолипидов в лецитине, с учетом степени конверсии индивидуальных групп фосфолипидов, а также их суммарной конверсии. Установлена эффективность применения ROHALASE PL-XTRA для получения гидролизованных лецитинов с заданным содержанием лизофосфолипидов. Варьирование значений рН реакционной среды в диапазоне от 3,5 до 4,0 и внесение в реакционную среду хлорида кальция в виде 0,1 и 0,4 М водных растворов не оказывают значимого влияния на эффективность процесса гидролиза. Определены эффективные режимы процесса гидролиза обезжиренного лецитина с применением ферментного препарата ROHALASE PL-XTRA при его дозировке 1,0 % к массе лецитина. Получены гидролизованные жидкие лецитины с заданной степенью суммарной конверсии фосфолипидов 40 и 60 % и содержанием лизофосфолипидов (22,4 ± 1,0) и (32,9 ± 1,0) % соответственно. Дальнейшими перспективными направлениями являются исследования в области оценки эффективности и особенностей проявления свойств полученными пищевыми добавками для обоснования их применения в технологиях продуктов питания.
обезжиренный лецитин, фосфолипиды, гидролиз, фосфолипаза А2, лизофосфолипиды, пищевые добавки, гидролизованные лецитины
Введение. Пищевые добавки – гидролизованные лецитины Е322 (ii), отличаются от стандартных лецитинов повышенным содержанием лизофосфолипидов (лизоФЛ).
Специфическое химическое строение молекул лизоФЛ обусловливает не только их уникальную биологическую активность – детергентное действие, способность изменять механические свойства липидных мембран, взаимодействовать с сопряженными G-белками и рецепторами [1, 2], но и технологические свойства, в первую очередь – эмульгирующие [3–5].
Более высокие эмульгирующие свойства гидролизованных лецитинов, по сравнению со стандартными лецитинами, обусловлены более сильным гидрофильным характером молекул лизоФЛ по сравнению с молекулами фосфолипидов (ФЛ) [4].
Известно, что чем выше содержание лизоФЛ в гидролизованных лецитинах, тем выше значение их гидрофильно-липофильного баланса (ГЛБ), а следовательно, и способность стабилизировать эмульсии «масло в воде». Это значительно расширяет область применения таких лецитинов в пищевых системах, содержащих преимущественно водную фазу [5, 6].
Так, значение ГЛБ стандартного жидкого лецитина не превышает 4, а значение ГЛБ частично гидролизованных лецитинов может варьироваться от 5 до 8 в зависимости от содержания лизоФЛ [7, 8].
В связи с этим гидролизованные лецитины, по сравнению со стандартными лецитинами, имеют значительные перспективы для широкого применения в качестве ПАВ и натуральных эмульгаторов в технологиях продуктов питания, так как в зависимости от количественного содержания в их составе лизоФЛ, обусловливающих ГЛБ гидролизованных лецитинов, можно регулировать их растворимость в масляной и/или водной фазе пищевых систем [9].
Гидролизованные лецитины получают в промышленном масштабе с применением ферментов – фосфолипазы А1 (PLA1) и фосфолипазы А2 (PLA2), гидролизующих сложноэфирную связь в молекуле ФЛ в положении sn-1 или sn-2 соответственно, с образованием лизоФЛ и свободных жирных кислот (СЖК) [10].
Схематичное изображение реакции гидролиза с применением указанных фосфолипаз приведено на рисунке 1.
Рис. 1. Схематичное изображение реакции гидролиза ФЛ с применением фосфолипазы А1 (PLA1) и фосфолипазы А2 (PLA2): R1, R2 – ацилы жирных кислот; Х – фосфатная группа
с остатком холина/этаноламина/инозитола/ и др.
Schematic representation of the reaction of PL hydrolysis using phospholipase A1 (PLA1)
and phospholipase A2 (PLA2): R1, R2 - fatty acid acyls; X - phosphate group
with a choline/ethanolamine/inositol residue, etc.
Следует отметить, что в настоящее время на российском рынке присутствуют только импортные гидролизованные лецитины (в основном индийского и китайского производства), что связано с отсутствием отечественных, эффективно масштабируемых технологий их получения.
Это обусловлено многими факторами, в том числе и выбором экономически доступного фермента, выпускаемого в промышленных масштабах, а также достаточно трудно достижимой эффективностью процесса гидролиза ФЛ, который осуществляется на границе раздела фаз «ФЛ-вода», из-за низкой растворимости лецитина в воде.
Необходимо отметить, что в настоящее время широкий выпуск фосфолипаз для применения в промышленных целях преимущественно осуществляется за рубежом [11]. В нашей стране ГК «Эфко» сравнительно недавно налажен выпуск PLA2, которая обеспечивает внутренние потребности указанной компании в обработке яичного желтка при производстве майонеза.
Некоторые коммерчески доступные ферментные препараты с активностью PLA1 и PLA2 представлены в таблице 1.
Коммерческие ферментные препараты не только эффективны для проведения ферментативной гидратации растительных масел, обработки яичного желтка и т. д., но и могут быть использованы для получения гидролизованного лецитина.
В частности, в работе [12] показана эффективность применения ферментного препарата Lecitase Ultra с активностью PLA1 для гидролиза подсолнечного лецитина с получением гидролизованного лецитина.
Однако известно, что при гидролизе ФЛ с применением PLA1 возможна миграция ацила в молекуле лизоФЛ из положения sn-2 в положение sn-1 с последующим гидролизом и образованием нежелательных глицерилфосфорильных соединений [13].
Таблица 1
Коммерчески доступные ферментные препараты фосфолипаз А1 и А2
Commercially available enzyme preparations phospholipases A1 and A2
|
Коммерческое название |
Тип фосфоли-пазы А |
Источник (организм/ штамм-продуцент) |
Производитель (страна производства) |
Применение в пищевой промышленности |
|
Lecitase 10 L |
PLA2 |
Поджелудочная железа свиньи |
Novozymes A/S (США) |
Ферментативная гидратация растительных масел |
|
Lecitase Ultra |
PLA1 |
Aspergillus oryzae |
Novozymes A/S (США) |
Ферментативная гидратация растительных масел |
|
Rohalase PL-XTRA |
PLA2 |
Trichoderma reesei |
AB Enzymes GmbH (США) |
Ферментативная гидратация растительных масел, модификация лецитинов |
|
Purifine PLA1 |
PLA1 |
Aspergillus niger |
DSM Food Specialties (США) |
Ферментативная гидратация растительных масел |
|
YieldMax |
PLA1 |
Aspergillus oryzae |
Novozymes A/S/Christian Hansen A/S (Дания) |
Ферментативный гидролиз молочного жира в производстве сыра |
|
Maxapal A2 |
PLA2 |
Aspergillus niger |
DSM Food Specialties (Нидерланды) |
Ферментативная обработка яичного желтка в производстве майонеза |
|
CAKEZYME SMART 5D |
PLA2 |
Aspergillus niger |
DSM Food Specialties-Firmenich (Германия) |
Снижение вязкости теста в производстве хлебобулочных и мучных кондитерских изделий |
Учитывая это, PLA1 преимущественно используются в комбинации с липазами для ферментативной переэтерификации ФЛ с определенными жирными кислотами (например, полиненасыщенными жирными кислотами) с целью получения гидролизованных лецитинов, предназначенных для фармацевтической промышленности.
Для получения пищевых добавок – гидролизованных лецитинов с улучшенными эмульгирующими свойствами наиболее широко применяются ферментные препараты, содержащие PLA2.
PLA2 гидролизует ФЛ в водном растворе только на поверхности раздела фаз «ФЛ–вода». Наиболее простым представлением механизма гидролиза ФЛ с применением PLA2 является представление воздействия указанного фермента на липидный бислой, организованный молекулами ФЛ на границе раздела фаз «ФЛ–вода» (рис. 2) [14].
Рис. 2. Схематичное изображение механизма гидролиза ФЛ в бислое с применением PLA2:
I – первая стадия: фермент связывается с липидным бислоем, захватывает и гидролизует ФЛ
с высвобождением продуктов реакции – лизоФЛ и жирной кислоты; II – вторая стадия: продукты гидролиза распределяются в липидном бислое; III – третья стадия: разрушение бислоя
в результате накопления продуктов гидролиза
Schematic representation of the mechanism of PL hydrolysis in the bilayer using PLA2: I – first stage: the enzyme binds to the lipid bilayer, captures and hydrolyzes PL with the release of reaction products – lysoPL and fatty acid; II – second stage: second stage: hydrolysis products are distributed in the lipid
bilayer; III – third stage: destruction of the bilayer as a result of accumulation of hydrolysis products
Однако имеются исследования, показывающие, что на активность PLA2 влияет вид надмолекулярной организации, заряд и упорядоченность упаковки молекул ФЛ на границе раздела фаз «ФЛ – вода» [15]. Кроме того, скорость гидролиза для разных групп ФЛ может отличаться, что также является особенностью фосфолипаз, в том числе PLA2 (субстратная специфичность) [15].
Помимо этого, большинство PLA2 являются кальцийзависимыми ферментами, однако в настоящее время имеется обширная группа ферментов внутри семейства PLA2, на активность которых не оказывают влияние ионы кальция [10].
Температура, дозировка фермента, рН реакционной среды, а также ее состав, например, введение в реакционную смесь органических растворителей для лучшего растворения ФЛ, и продолжительность ферментативной реакции являются определяющими факторами для получения гидролизованных лецитинов с различным содержанием лизоФЛ.
Следует отметить, что в пищевых технологиях наиболее широко применяются частично гидролизованные лецитины со степенью конверсии (гидролиза) ФЛ от 30 до 60 %, гидролиз ФЛ в лецитине менее 30 % не будет оказывать существенного влияния на изменение значения ГЛБ лецитина, а следовательно, является нецелесообразным [8].
Таким образом, учитывая, что в России промышленный выпуск гидролизованных лецитинов отсутствует, в связи с чем в технологиях продуктов питания используются только импортные гидролизованные лецитины, исследования в области разработки технологий получения пищевых добавок – гидролизованных лецитинов с заданной степенью конверсии ФЛ, а следовательно, и с различным содержанием лизоФЛ, являются перспективными и актуальными в настоящее время.
Цель исследования – разработка технологии получения пищевых добавок – гидролизованных жидких лецитинов с заданным содержанием лизофосфолипидов.
Задачи: выявить эффективность применения ферментного препарата ROHALASE PL-XTRA, содержащего PLA2, для получения гидролизованных лецитинов с различным содержанием лизоФЛ; изучить влияние основных факторов на эффективность гидролиза ФЛ, содержащихся в обезжиренном лецитине; разработать технологические режимы получения гидролизованных жидких лецитинов.
Объекты и методы. Объекты исследования: гидролизованные жидкие лецитины, полученные из обезжиренного лецитина.
Обезжиренный лецитин, полученный в лабораторных условиях из подсолнечного жидкого лецитина по разработанной нами технологии [16], представляет собой порошок светло-желтого цвета с массовой долей веществ, нерастворимых в ацетоне, – 96,9 %, в том числе ФЛ – 76,4, из них фосфатидилхолинов (ФХ) – 22,1; фосфатидилинозитолов (ФИ) – 16,2; фосфатидилэтаноламинов (ФЭА) – 9,7; фофатидных кислот (ФК) – 7,5 %.
Ферментативный гидролиз ФЛ, содержащихся в обезжиренном лецитине, осуществляли с помощью выпускаемого в промышленных объемах и широко применяемого для ферментативной гидратации растительных масел пищевого ферментного препарата ROHALASE PL-XTRA (AB Enzymes, Германия), содержащего фосфолипазу А2 (PLA2) микробного происхождения с активностью 10 000 ед/г, представляющего собой жидкость светло-коричневого цвета. Отличительной особенностью данного ферментного препарата является проявление его активности при низких значениях рН (от 3,5 до 4,5).
Процесс гидролиза ФЛ, содержащихся в обезжиренном лецитине, проводили следующим образом: обезжиренный лецитин и дистиллированную воду, предварительно нагретую до 50 °С, в соотношении, равном 1 : 4 (по массе), интенсивно перемешивали с применением верхнеприводной мешалки Eurostar 200 Control P4 в течение 15 мин. В эту смесь вносили расчетное количество буферного раствора с получением реакционной среды с заданным значением рН. Затем в реакционную среду вносили ферментный препарат ROHALASE PL-XTRA, дозировку которого рассчитывали с учетом содержания ФЛ в лецитине (т. е. субстрата) и заявленной производителем активности фермента. Процесс гидролиза осуществляли при постоянном перемешивании и поддержании температуры на заданном уровне.
После проведения процесса гидролиза инактивацию фермента, содержащегося в ферментированной массе, проводили путем нагревания образцов до температуры 100 °С в течение 15 мин. Затем ферментированную массу сушили при температуре 60 °С под вакуумом до содержания влаги в высушенном продукте, представляющем собой гидролизованный жидкий лецитин, не более 1 %.
Эффективность процесса гидролиза оценивали по степени конверсии субстрата, т. е. ФЛ, содержащихся в обезжиренном лецитине, при этом учитывали степень конверсии индивидуальных групп ФЛ, а именно ФХ, ФЭА, ФИ и ФК, (КФЛi), в %, по формуле (1), а также степень суммарной конверсии указанных индивидуальных групп ФЛ (К∑ФЛ), в %, по формуле (2)
, (1)
где 
– содержание i-й индивидуальной группы ФЛ в лецитине до гидролиза, %; 
– содержание i-й индивидуальной группы ФЛ в лецитине после гидролиза, %.
, (2)
где 
– содержание ФХ, ФЭА, ФИ и ФК соответственно в лецитине до гидролиза, %; 
– содержание ФХ, ФЭА, ФИ и ФК соответственно в лецитине после гидролиза, %.
Определение содержания индивидуальных групп ФЛ в лецитинах до и после гидролиза осуществляли методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) с обработкой полученных хроматограмм с помощью денситометра SORBFIL (Россия) в программе Sorbfil TLC View, при этом в качестве неподвижной среды использовали пластинки «Sorbfil», а в качестве подвижной фазы – систему растворителей хлороформ : метанол : вода (65 : 25 : 4). Идентификацию индивидуальных групп ФЛ (ФХ, ФИ, ФЭА и ФК), а также лизоФЛ (лизоФХ, лизоФИ, лизоФЭА и лизоФК) на хроматограммах осуществляли по стандартам-метчикам (производитель Larodan).
Экспериментальные данные обрабатывали с применением пакета программ MS Excel и Statistica 9.0.
Результаты и их обсуждение. На первом этапе исследовали степень конверсии основных индивидуальных групп ФЛ, содержащихся в лецитине, а именно ФХ, ФЭА, ФИ и ФК, в результате гидролиза с применением ферментного препарата ROHALASE PL-XTRA. На рисунке 3 приведены полученные данные.
Следует отметить, что гидролиз проводили при температуре 50 °С, значении рН реакционной среды 4,0 и дозировке ферментного препарата 0,2 % к массе лецитина в течение 60 мин. Через каждые 15 мин осуществляли отбор ферментированной массы с последующим ее нагреванием для инактивации фермента и сушкой под вакуумом до содержания влаги не более 1,0 %.
Рис. 3. Степень конверсии ФЭА (
|
|
|
|
|
|
|
|
в результате гидролиза с применением ROHALASE PL-XTRA в течение 60 минут
The degree of conversion of PE (
|
|
|
|
|
|
|
|
of hydrolysis using ROHALASE PL-XTRA for 60 minutes
Из приведенных данных видно, что наибольшей конверсии в течение исследуемой продолжительности гидролиза подвергаются ФЭА. Степень конверсии ФХ в результате гидролиза в течение 60 мин несколько ниже по сравнению с ФЭА. Степень конверсии ФК практически в 2 раза ниже степени конверсии ФЭА на каждом временном участке процесса гидролиза.
Наиболее низкая степень конверсии по сравнению с ФЭА, ФХ и ФК наблюдается у ФИ. Полученные результаты согласуются с данными, приведенными в работе [17], в которой гидролиз подсолнечного лецитина осуществляли с применением ферментного препарата LysoMax Oil (Danisco), содержащего PLA2 микробного происхождения.
Различную степень конверсии основных индивидуальных групп ФЛ, содержащихся в лецитине, а именно ФХ, ФЭА, ФИ и ФК, в результате гидролиза с применением ферментных препаратов, содержащих PLA2, можно объяснить избирательностью (специфичностью) PLA2 по отношению к полярной группе молекулы ФЛ.
Учитывая, что на степень конверсии ФЛ, содержащихся в лецитине, а следовательно, и на эффективность гидролиза лецитина будут оказывать влияние такие факторы, как рН реакционной среды, температура, продолжительность гидролиза, а также, в случае PLA2, наличие в реакционной среде кофактора – ионов кальция, то исследовали влияние указанных факторов.
На этапе исследования влияния значения рН реакционной среды на степень конверсии индивидуальных групп ФЛ, а именно на степень конверсии ФЭА, ФХ, ФК и ФИ, содержащихся в лецитине, а также на степень их суммарной конверсии, значения рН реакционной среды образцов обезжиренного лецитина с дистиллированной водой варьировали в диапазоне от 3,0 до 5,0, при этом процесс гидролиза проводили при дозировке ферментного препарата 0,2 % к массе лецитина и температуре 50 °С в течение 60 мин. Полученные данные приведены в таблице 2.
Таблица 2
Влияние значения рН реакционной среды на степень конверсии индивидуальных групп ФЛ
и на степень их суммарной конверсии в процессе гидролиза, %
The influence of the pH value of the reaction medium on the degree of conversion
of individual PL groups and on the degree of their total conversion during hydrolysis
|
Значение рН реакционной среды |
Степень конверсии |
Степень суммарной конверсии ФЛ (КƩФЛ), % |
|||
|
ФЭА (КФЭА) |
ФХ (КФХ) |
ФК (КФК) |
ФИ (КФИ) |
||
|
3,0 |
38,8±0,9 |
33,8±0,7 |
30,4±1,1 |
21,0±0,9 |
30,5±1,0 |
|
3,5 |
48,7±0,7 |
45,7±0,9 |
34,9±0,8 |
20,9±1,2 |
38,0±0,9 |
|
4,0 |
53,5±0,8 |
50,4±1,0 |
31,7±0,7 |
19,7±0,7 |
38,1±0,8 |
|
4,5 |
31,3±0,9 |
34,6±0,8 |
18,7±1,0 |
17,8±0,9 |
27,0±0,7 |
|
5,0 |
26,0±0,9 |
26,3±0,7 |
11,2±0,9 |
11,4±0,8 |
20,0±1,2 |
Из приведенных данных видно, что значения рН реакционной среды в диапазоне от 3,0 до 4,5 оказывают влияние на степень конверсии ФЭА, ФХ и ФК, а степень конверсии ФИ в указанном диапазоне значений рН практически не изменяется. Наибольшая степень суммарной конверсии ФЛ в лецитине в процессе гидролиза наблюдается в диапазоне значений рН реакционной среды от 3,5 до 4,0, при этом повышение значений рН реакционной среды до 4,5 и более приводит к снижению степени конверсии как индивидуальных групп ФЛ, так и степени их суммарной конверсии.
Таким образом, оптимальным диапазоном значений рН реакционной среды для проведения процесса гидролиза обезжиренного лецитина с применением исследуемого ферментного препарата является диапазон от 3,5 до 4,0. Дальнейшие исследования проводили при значении рН реакционной среды, равном 4,0.
На следующем этапе исследования изучали влияние внесения в реакционную среду хлорида кальция на степень суммарной конверсии ФЛ, содержащихся в лецитине.
Для этого было подготовлено два экспериментальных образца гидролизованного жидкого лецитина. Для подготовки 1-го образца гидролизованного жидкого лецитина обезжиренный лецитин и 0,1 М раствор хлорида кальция в дистиллированной воде, предварительно нагретый до 50 °С, в соотношении, равном 1 : 4 (по массе), интенсивно перемешивали с последующим доведением значения рН полученной реакционной среды до 4,0 и проводили процесс гидролиза при дозировке ферментного препарата 0,2 % к массе обезжиренного лецитина и температуре 50 °С в течение 60 мин.
Подготовку 2-го образца гидролизованного жидкого лецитина осуществляли аналогичным образом, с единственным отличием в том, что для получения реакционной среды вместо 0,1 М раствора хлорида кальция в дистиллированной воде брали 0,4 М раствора хлорида кальция в дистиллированной воде.
В качестве объекта сравнения служил контрольный образец гидролизованного жидкого лецитина, полученный без внесения в реакционную среду хлорида кальция.
На рисунке 4 приведены данные по влиянию хлорида кальция в реакционной среде на степень суммарной конверсии ФЛ, содержащихся в экспериментальных образцах лецитина, по сравнению со степенью суммарной конверсии ФЛ в контрольном образце лецитина.
Рис. 4. Влияние хлорида кальция в реакционной среде на степень суммарной конверсии ФЛ,
содержащихся в лецитине:
|
|
|
|
|
|
The effect of calcium chloride in the reaction medium on the degree of total conversion of PL contained in lecithin:
|
|
|
|
|
|
Из приведенных данных видно, что внесение в реакционную среду хлорида кальция в виде его водного раствора различной концентрации не оказывает значимого влияния на эффективность гидролиза ФЛ с применением ферментного препарата ROHALASE PL-XTRA.
Кроме того, внесение в реакционную среду раствора хлорида кальция в избыточной концентрации (0,4 М водный раствор) приводит к некоторому расслоению реакционной среды, а также к увеличению времени сушки ферментированной массы после окончания процесса гидролиза.
Учитывая, что в спецификации ферментного препарата ROHALASE PL-XTRA конкретно не указана группа PLА2, можно сделать вывод о том, что входящая в ферментный препарат PLА2 является кальций-независимой.
На следующем этапе изучали влияние температуры на степень суммарной конверсии ФЛ в процессе гидролиза обезжиренного лецитина при значении рН реакционной среды 4,0, дозировке ферментного препарата 0,2 % к массе лецитина в течение 60 мин. Полученные экспериментальные данные приведены на рисунке 5.
Из данных рисунка 5 видно, что температура играет важную роль в процессе ферментативного гидролиза. Так, повышение температуры с 40 до 50 °С способствует повышению степени суммарной конверсии ФЛ, что, по-видимому, обусловлено увеличением растворимости субстрата, т. е. ФЛ, и снижению вязкости среды, лучшему ее перемешиванию, а следовательно, и увеличению межмолекулярного контакта ФЛ с ферментом. Однако при повышении температуры до 60 °С фермент становится более восприимчивым к термической дезактивации, что приводит к снижению его каталитической активности.
Рис. 5. Влияние температуры на степень суммарной конверсии ФЛ,
содержащихся в лецитине:
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Measuring the temperature by the degree of total conversion of PL contained in lecithin:
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Для исследования влияния дозировки ферментного препарата ROHALASE PL-XTRA на степень суммарной конверсии ФЛ, содержащихся в обезжиренном лецитине, проводили процесс гидролиза образцов лецитина при следующих дозировках ферментного препарата: 0,2; 0,4; 0,8; 1,2; 1,6 и 2,0 % к массе лецитина, при этом значение рН реакционной среды – 4,0, температура – 50 °С и продолжительность гидролиза – 60 мин были одинаковыми для всех образцов лецитина.
На рисунке 6 приведены полученные данные по влиянию дозировки ферментного препарата на степень суммарной конверсии ФЛ, содержащихся в лецитине.
Рис. 6. Влияние дозировки ферментного препарата ( % к массе лецитина)
на степень суммарной конверсии ФЛ, содержащихся в лецитине:
|
|
|
|
|
|
The effect of the dosage of the enzyme preparation in % of the mass of lecithin, on the degree of total conversion of PL contained in lecithin:
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Из данных рисунка 6 видно, что в течение 15 минут гидролиза увеличение дозировки ферментного препарата ROHALASE PL-XTRA с 0,2 до 2,0 % к массе лецитина обеспечивает повышение степени суммарной конверсии ФЛ, содержащихся в лецитине, в 2,2 раза. Дальнейшее увеличение продолжительности процесса гидролиза образца лецитина (30 мин и более) при дозировке ферментного препарата 2,0 % к массе лецитина не приводит к значительному росту степени суммарной конверсии ФЛ, содержащихся в лецитине.
Это, по-видимому, связано с высоким содержанием в реакционной среде продуктов гидролиза, а именно – свободных жирных кислот и лизоФЛ, затрудняющих захват PLA2 молекул ФЛ (см. рис. 2), в отличие от образцов лецитина с внесением ферментного препарата в меньших дозировках, в которых для увеличения содержания в реакционной среде продуктов гидролиза требуется большая продолжительность процесса гидролиза (рис. 7).
Рис. 7. Влияние продолжительности процесса гидролиза на степень суммарной конверсии ФЛ, содержащихся в лецитине, при дозировке ферментного препарата, % к массе лецитина:
1 – 0,2; 2 – 0,4; 3 – 0,8; 4 – 1,2; 5 – 1,6; 6 – 2,0
The influence of the duration of the hydrolysis process on the degree of total conversion of PL contained in lecithin at a dosage of the enzyme preparation in % of the lecithin mass:
1 – 0.2; 2 – 0.4; 3 – 0.8; 4 – 1.2; 5 – 1.6; 6 – 2.0
Таким образом, установлено, что наиболее значимыми факторами для проведения эффективного процесса гидролиза обезжиренного лецитина с применением ферментного препарата ROHALASE PL-XTRA являются дозировка ферментного препарата, температура и продолжительность процесса гидролиза. Варьирование значений рН реакционной среды в диапазоне от 3,5 до 4,0 и внесение в реакционную среду хлорида кальция в виде 0,1 и 0,4 М водных растворов не оказывают значимого влияния на степень суммарной конверсии ФЛ, содержащихся в лецитине, а следовательно, и на эффективность процесса гидролиза.
Для получения гидролизованных лецитинов с различной степенью конверсии ФЛ, а следовательно, и с различным содержанием лизоФЛ, был проведен полный факторный эксперимент с варьированием основных факторов, а именно – дозировки ферментного препарата, температуры и продолжительности гидролиза – на трех уровнях (табл. 3).
Таблица 3
Переменные факторы и уровни их варьирования
Variable factors and their levels of variation
|
Фактор и его код |
Уровень варьирования факторов |
||
|
нижний |
средний |
верхний |
|
|
Дозировка ферментного препарата, % к массе лецитина (Cфп) |
0,8 |
1,0 |
1,2 |
|
Продолжительность гидролиза, мин ( |
15 |
60 |
90 |
|
Температура гидролиза, °С (t) |
45 |
50 |
55 |
Функцией отклика в данном эксперименте являлась степень суммарной конверсии ФЛ, содержащихся в лецитине (КƩФЛ).
Экспериментальные данные по влиянию переменных факторов на функцию отклика представлены в таблице 4, а их графическая интерпретация – на рисунке 8.
Влияние переменных факторов на функцию отклика
The influence of variable factors on the response function
|
Номер опыта |
Переменный фактор |
Функция отклика |
||
|
Сфп,% к массе лецитина |
|
t, °С |
КƩФЛ, % |
|
|
1 |
0,8 |
15 |
45 |
34,8±0,9 |
|
2 |
1,0 |
15 |
45 |
37,7±1,1 |
|
3 |
1,2 |
15 |
45 |
40,0±1,0 |
|
4 |
0,8 |
60 |
45 |
46,8±1,2 |
|
5 |
1,0 |
60 |
45 |
50,2±1,0 |
|
6 |
1,2 |
60 |
45 |
52,7±0,9 |
|
7 |
0,8 |
90 |
45 |
52,3±1,3 |
|
8 |
1,0 |
90 |
45 |
55,9±0,9 |
|
9 |
1,2 |
90 |
45 |
58,1±1,1 |
|
10 |
0,8 |
15 |
50 |
37,9±1,4 |
|
11 |
1,0 |
15 |
50 |
41,1±0,9 |
|
12 |
1,2 |
15 |
50 |
42,9±1,2 |
|
13 |
0,8 |
60 |
50 |
49,9±0,9 |
|
14 |
1,0 |
60 |
50 |
53,2±1,1 |
|
15 |
1,2 |
60 |
50 |
54,7±0,8 |
|
16 |
0,8 |
90 |
50 |
56,9±0,9 |
|
17 |
1,0 |
90 |
50 |
59,7±1,3 |
|
18 |
1,2 |
90 |
50 |
61,5±1,3 |
|
19 |
0,8 |
15 |
55 |
38,7±1,2 |
|
20 |
1,0 |
15 |
55 |
40,7±1,0 |
|
21 |
1,2 |
15 |
55 |
43,6±1,2 |
|
22 |
0,8 |
60 |
55 |
51,4±0,8 |
|
23 |
1,0 |
60 |
55 |
54,3±0,9 |
|
24 |
1,2 |
60 |
55 |
56,3±1,2 |
|
25 |
0,8 |
90 |
55 |
57,5±1,4 |
|
26 |
1,0 |
90 |
55 |
60,4±1,1 |
|
27 |
1,2 |
90 |
55 |
62,2±1,6 |
а б в
Рис. 8. Влияние температуры и продолжительности гидролиза на степень суммарной конверсии ФЛ, содержащихся в лецитине (КƩФЛ), при дозировке ферментного препарата 0,8 % (а), 1,0 % (б) и 1,2 % (в) к массе лецитина
The effect of temperature and duration of hydrolysis on the degree of total conversion of PL contained in lecithin (KƩPL) at a dosage of enzyme preparation of 0.8 % (a), 1.0 % (б) and 1.2 % (в)
to the mass of lecithin
В результате математической обработки экспериментальных данных нами получено уравнение, адекватно описывающие процесс гидролиза обезжиренного лецитина с применением ферментного препарата ROHALASE PL-XTRA:
|
|
(3) |
где t – температура гидролиза, °С; 
– продолжительность гидролиза, мин; Сфп – дозировка ферментного препарата, % к массе обезжиренного лецитина.
Коэффициент детерминации (R2) уравнения (3) – 0,9957. С учетом уравнения (3) получено уравнение (4), характеризующее зависимость продолжительности процесса гидролиза от температуры и степени суммарной конверсии ФЛ, содержащихся в лецитинею:
|
|
(4) |
Коэффициент детерминации (R2) уравнения (4) – 0,9668.
На основании уравнения (4) была определена продолжительность процесса гидролиза обезжиренного лецитина с применением ферментного препарата ROHALASE PL-XTRA при его дозировке 1,0 % к массе обезжиренного лецитина и температуре процесса гидролиза 50 °С для получения гидролизованных жидких лецитинов с заданной степенью суммарной конверсии ФЛ, а именно – 40 и 60 %.
В результате реализации разработанных эффективных режимов гидролиза обезжиренного лецитина получены гидролизованные жидкие лецитины с заданной степенью суммарной конверсии ФЛ, соответствующей 40 и 60 %, и содержанием в готовых продуктах – гидролизованных жидких лецитинах лизоФЛ (22,4 ± 1,0) % и (32,9 ± 1,0) %, соответственно (табл. 5).
Таблица 5
Эффективные технологические режимы гидролиза ФЛ, содержащихся
в обезжиренном лецитине, с применением ферментного препарата ROHALASE PL-XTRA*
Effective technological modes of hydrolysis of PL contained
in deoiled lecithin using the enzyme preparation ROHALASE PL-XTRA*
|
Заданное значение степени суммарной конверсии ФЛ (КƩФЛ), % |
Дозировка Ферментного препарата, % к массе обезжиренного лецитина |
Температура процесса гидролиза, °С |
Продолжительность процесса гидролиза, мин |
Фактическое содержание лизоФЛ в полученном гидролизованном жидком лецитине, % |
|
40 |
1,0 |
50 |
14 |
22,4±1,0 |
|
60 |
100 |
32,9±1,0 |
(*) – при значении рН реакционной среды, равном 4,0.
Заключение. В результате комплекса проведенных исследований показана эффективность применения ферментного препарата ROHALASE PL-XTRA, содержащего PLА2, для получения пищевых добавок – гидролизованных лецитинов с различным содержанием лизоФЛ. Установлено, что индивидуальные группы ФЛ, содержащиеся в обезжиренном лецитине, по степени конверсии в результате гидролиза с применением ROHALASE PL-XTRA можно расположить в ряд по убыванию: ФЭА→ФХ→ФК→ФИ.
Установлены наиболее значимые факторы, оказывающие влияние на степень суммарной конверсии ФЛ, содержащихся в обезжиренном лецитине, а именно: дозировка ферментного препарата, температура и продолжительность процесса гидролиза. Варьирование значений рН реакционной среды в диапазоне от 3,5 до 4,0 и внесение в реакционную среду хлорида кальция в виде 0,1 М и 0,4 М водных растворов не оказывают значимого влияния на степень суммарной конверсии ФЛ, содержащихся в обезжиренном лецитине, а следовательно, и на эффективность процесса гидролиза.
В результате трехфакторного эксперимента и математической обработки экспериментальных данных получены уравнения, позволяющие определить эффективные режимы процесса гидролиза обезжиренного лецитина с применением ферментного препарата ROHALASE PL-XTRA для получения гидролизованного жидкого лецитина с заданной степенью суммарной конверсии ФЛ.
При реализации разработанных эффективных режимов гидролиза обезжиренного лецитина получены гидролизованные жидкие лецитины со степенью суммарной конверсии ФЛ, соответствующей 40 и 60 %, и содержанием в готовых продуктах – гидролизованных жидких лецитинах лизоФЛ (22,4 ± 1,0) % и (32,9 ± 1,0) %, соответственно.
Дальнейшими перспективными исследованиями являются исследования в области оценки эффективности и особенностей проявления свойств полученными пищевыми добавками – гидролизованными лецитинами со степенью суммарной конверсии ФЛ, соответствующей 40 и 60 %, для обоснования их эффективного применения в технологиях продуктов питания.
1. Omi J., Kano K., Aoki J. Current Knowledge on the Biology of Lysophosphatidylserine as an Emerging Bioactive Lipid // Cell Biochemistry and Biophysics. 2021. Vol. 79. P. 497–508. DOI:https://doi.org/10.1007/s 12013-021-00988-9.
2. Kano K., Aoki J., Hla T. Lysophospholipid Mediators in Health and Disease // Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 2022. Vol. 17. P. 459–483. DOI:https://doi.org/10.1146/annurev-pathol-050420-025929.
3. Sun X., Zhang L., Tian S., et al. Phospholipid composition and emulsifying properties of rice bran lecithin from enzymatic degumming // LWT. 2020. Vol. 117. P. 108588. DOI:https://doi.org/10.1016/j.lwt.2019.108588.
4. Gutiérrez‐Méndez N., Chavez‐Garay D.R., Leal‐Ramos M.Y. Lecithins: A comprehensive review of their properties and their use in formulating microemulsions // Journal of Food Biochemistry. 2022. Vol. 46. P. e14157. DOI:https://doi.org/10.1111/jfbc.14157.
5. El-Abhar M.M., Mahmoud G.I., Hanafy E.A., et al. Comparative study of modified soy lecithins as oil in water (O/W) emulsifiers // Egyptian Journal of Chemistry. 2020. Vol. 63, N 8. P. 3015–3027. DOI:https://doi.org/10.21608/EJCHEM.2020.27536.2579.
6. Bot F., Cossuta D., O'Mahony J.A. Inter-relationships between composition, physicochemical properties and functionality of lecithin ingredients // Trends in Food Science & Technology. 2021. Vol. 111. P. 261–270. DOI:https://doi.org/10.1016/j.tifs.2021.02.028.
7. van Nieuwenhuyzen W. Production and Utilization of Natural Phospholipids. In: Ahmad M.U., Xu X., editors. Polar Lipids. Elsevier, 2015. P. 245–276. DOI:https://doi.org/10.1016/B978-1-63067-044-3.50013-3.
8. Reddy Jala R.C., Chen B., Li H., et al. Enzymatic preparation and characterization of soybean lecithin-based emulsifiers // Grasas Aceites. 2016. Vol. 67, is. 4. P. e168. DOI:https://doi.org/10.3989/gya.0571161.
9. Teixé-Roig J., Oms-Oliu G., Odriozola-Serrano I., et al. Emulsion-Based Delivery Systems to Enhance the Functionality of Bioactive Compounds: Towards the Use of Ingredients from Natural, Sustainable Sources // Foods. 2023. Vol. 12. P. 1502. DOI:https://doi.org/10.3390/foods12071502.
10. Филькин C.Ю., Липкин А.В., Федоров А.Н. Суперсемейство фосфолипаз: структура, функции и применение в биотехнологии // Успехи биологической химии. 2020. Т. 60. С. 369–410.
11. Cerminati S., Paoletti L., Aguirre A., et al. Industrial uses of phospholipases: current state and future applications // Appl Microbiol Biotechnol. 2019. Vol. 103. P. 2571–2582. DOI:https://doi.org/10.1007/s00253-019-09658-6.
12. Goñi M.L., Pacheco C., Constenla D.T., et al. Solvent-free enzymatic hydrolysis of non-polar lipids in crude sunflower lecithin using phospholipase A1 (Lecitase® Ultra) // Biocatalysis and Biotransformation. 2017. Vol. 36, is. 5. P. 341–351. DOI:https://doi.org/10.1080/10242422.2017.1376662.
13. Li Y., Dai L., Liu D., et al. Progress & Prospect of Enzyme-Mediated Structured Phospholipids Preparation // Catalysts. 2022. Vol. 12, is. 7. P. 795. DOI:https://doi.org/10.3390/catal12070795.
14. Alekseeva A.S., Boldyrev I.A. Phospholipase A2. Methods for Activity Monitoring // Biochem. Moscow Suppl. Ser. A. 2020. Vol. 14. P. 267–278. DOI:https://doi.org/10.1134/S1990747820040030.
15. Лисовая Е.В., Викторова Е.П., Свердличенко А.В., Жане М.Р., Великанова Е.В., Ачмиз А.Д. Способ получения пищевого фосфолипидного продукта. Патент РФ на изобретение № 2787387. 09.01.2023. Бюл. № 1. Доступно по: https://patentimages.storage.googleapis.com/75/ 09/e1/c40b20d5caad7e/RU2787387C1.pdf. Ссылка активна на 17 февраля 2024.
16. Литвинко Н.М. Гидролиз УФ-индуцированного перекисно-окисленного фосфатидилхолина фосфолипазами разной субстратной специфичности // Вес. Нац. акад. навук Беларусi. Сер. хiм. навук. 2021. Т. 57, № 2. С. 195–205. DOI:https://doi.org/10.29235/1561-8331-2021-57-2-195-205.
17. Cabezas D.M., Diehl B.W.K., Tomás M.C. Emulsifying properties of hydrolysed and low HLB sunflower lecithin mixtures // European Journal of Lipid Science and Technology. 2016. Vol. 118, is. 7. P. 975–983. DOI:https://doi.org/10.1002/ejlt.2015001.
