Республика Саха (Якутия), Россия
Цель исследования – изучение влияния крипротекторов различного состава на сохранение микрофлоры бактериального концентрата симбиотической закваски при замораживании. Зада- чи исследования: выбор вида и дозы криопротектора для замораживания симбиотического бак- териального концентрата; оценка уровня выживаемости жизнеспособных клеток; исследование ферментативной активности замороженного бактериального концентрата. Микрофлора бак- териального концентрата идентична естественной закваске для производства курунги. Объек- том исследования были крипротекторы глицерин, сахароза, желатин – вещества, препятству- ющие кристаллизации воды; бактериальный концентрат симбиотической курунговой закваски. В качестве базовой смеси использовали питательную среду с буферными солями. Применяли стандартные и общепринятые методы исследования. Титруемая кислотность – по ГОСТ 3624 титрованием 0,1 н. раствором едкого натра с фенолфталеином. Величина активной кислот- ности – по ГОСТ Р 53359-2009 потенциометрическим методом на приборе Анион-7000. Влияние криопротекторов на сохранение жизнеспособности микроорганизмов бактериального концен- трата симбиотической закваски исследовали замораживанием в морозильной камере до –25 °С со скоростью охлаждения 100 °С в минуту. Эффективность криопротекторов оценивали по ко- личеству жизнеспособных клеток основных групп микроорганизмов закваски и ферментативной активности размороженного бактериального концентрата. Полученные результаты показали, что применение 5 % глицерина и желатина свыше 5 % в составе защитной среды сохраняет исходные свойства бактериального концентрата, способствует выживанию дрожжевых клеток. Применение сахарозы обеспечивало сохранение только лактобактерий. Исследование фермен- тативной активности показало, что бактериальный концентрат, замороженный в защитной среде с 5 % глицерина, сквашивает молоко в течение 10–12 ч. Высокий уровень восстановления активности закваски связана с эндо- и экстрацеллюлярными свойствами глицерина.
симбиотическая закваска, курунга, защитная среда, глицерин, желатин, са- хароза, бактериальный концентрат, консервирование, замораживание, выживаемость клеток.
Введение. При производстве бактериальных концентратов важнейшей задачей является со- хранение качественных показателей в течение длительного времени. Наиболее распространен- ным способом консервирования бактериальных концентратов является замораживание и лиофи- лизация [4, 6, 9, 12]. Для защиты микроорганиз- мов от криоповреждений применяют защитные среды [6, 9]. Растворы «истинных» криопротек- торов при замораживании способствуют форми- рованию так называемого стекловидного льда, в то время как соединения, неспособные к протек- торному эффекту, образуют гексагональные кри- сталлы [6, 10]. Скорость образования льда, как известно, во многом зависит от способности того или иного вещества образовывать водородные связи – чем выше это свойство, тем быстрее сни- жается скорость роста кристаллов льда. Соеди- нения, обладающие способностью образовывать большое количество водородных связей с жид- кой фазой, проявляют защитные свойства. Такое свойство этих соединений способствует умень- шению количества способной к кристаллизации воды в клетке и изменению характера самой кристаллизации. Защитные вещества, связыва- ющие водород до определенной степени, могут стабилизировать поверхностную гидратацию клетки за счет упрочнения гидратационных ре- шеток, окружающих клетки, что уменьшает воз- можность их повреждения при замораживании [8, 9]. Эффективный криопротектор должен быть нетоксичным, при этом он должен поддерживать в растворенном состоянии соли и белки вплоть до эвтектического перехода в аморфное состоя- ние, то есть его растворы должны иметь низкую эвтектическую температуру, чтобы сократить температурный интервал воздействия твердой фазы на структуру вещества в процессе замо- раживания и отогрева. Для низкотемпературной консервации бактерий чаще всего используют
глицерин в концентрациях 5–25 % в составе во- дных растворов, жидких питательных сред, в со- четании с другими криозащитными веществами [1]. Лучшей средой для консервации бактерий, имеющих медицинское значение, по сообщению
R.K.A. Feltham с соавторами, является бульон Oxoid с 10 % глицерина. Выживаемость бактерий составляет 67–100 % [1, 11].
Из углеводов для хранения бактерий при низ- ких температурах используют глюкозу, сахарозу, лактозу, трегалозу в концентрациях 5–15 %. Счи- тается, что углеводы обладают менее выражен- ными криозащитными свойствами, чем глицерин, поэтому их рекомендуют применять в сочетании с другими протекторами. Однако было установлено, что протекторное действие сахарозы сопоставимо с глицерином для криоконсервации P. putida, E. coli и B. Thuringiensis [1]. Сахара, проникая в клетку и создавая там осмотическое давление, препят- ствуют образованию кристаллов льда и разруше- нию клетки в процессе замораживания [1, 5].
Среды, в которых в качестве коллоида вводит- ся желатин и агар-агар, нашли широкое примене- ние при производстве сухих живых вакцин, так как они лишены антигенных свойств. Наиболее часто применяемая доза желатина в защитных средах составляет 1–2 % [6, 7, 12]. Желатин увеличива- ет стабилизирующее действие среды и позволяет хранить высушенные культуры без создания ва- куума, не проникает в клетку, но заставляет кле- точную оболочку плотнее прилегать к цитоплазме, что важно при размораживании [5, 7].
Цель исследования: изучение влияния кри- протекторов различного состава на сохранение микрофлоры бактериального концентрата сим- биотической закваски при замораживании.
В связи с поставленной целью в работе реша- лись следующие задачи:
-
выбор вида и дозы криопротектора для за- мораживания симбиотического бактериального концентрата;
-
оценка уровня выживаемости жизнеспособ- ных клеток;
-
исследование ферментативной активности замороженного бактериального концентрата.
Объект и методы исследования. Объектом исследования были крипротекторы глицерин, сахароза, желатин; бактериальный концентрат симбиотической курунговой закваски [2, 3].
Использовали стандартные и общепринятые методы исследования. Титруемая кислотность – по ГОСТ 3624 титрованием 0,1 н. раствором едкого натра с фенолфталеином, выражается в градусах Тернера. Величина активной кислотно- сти – по ГОСТ Р 53359-2009 потенциометриче- ским методом на приборе Анион-7000.
Исследовали влияние криопротекторов на со- хранение жизнеспособности микроорганизмов бактериального концентрата симбиотической закваски замораживанием в морозильной каме- ре до –25 °С со скоростью охлаждения 100 °С в минуту. В качестве базовой смеси использовали свежую питательную среду с буферными соля- ми. Выживаемость клеток после замораживания оценивали по количествy жизнеспособных бакте-
рий относительно количества микроорганизмов в бактериальном концентрате до замораживания. Количество микроорганизмов оценивали методом предельных разведений на среде МRS культиви- рованием: термофильные лактобактерии – при 42 °С; мезофильные лактобактерии – при 30 °С.
Для определения количества жизнеспособ- ных клеток дрожжей использовали следующие среды:
-
дрожжи, сбраживающие лактозу, на карто- фельно-лактозной среде культивированием при 30 °С;
-
дрожжи, не сбраживающие лактозу, на кар- тофельно-глюкозной среде культивированием при 30 °С.
Результаты исследования и их обсужде- ние. При замораживании большое внимание уделяется составу защитных сред, обеспечива- ющих внутри- и внеклеточную защиту при замо- раживании. В качестве криопротекторов были использованы следующие вещества: глицерин, сахароза, желатин, – широко применяемые для консервирования микроорганизмов и обеспечи- вающие их высокую выживаемость [1, 4, 5, 7, 11]. В таблице 1 представлены характеристики об- разцов, использованных для исследования.
Содержание криопротекторов в защитной среде
Таблица 1
|
Номер образца |
Количество криопротектора, % |
|||
|
Глицерин |
Желатин |
Сахароза |
||
|
1 |
2 |
– |
– |
|
|
2 |
5 |
|||
|
3 |
7 |
|||
|
4 |
2 |
|||
|
5 |
5 |
|||
|
6 |
7 |
|||
|
7 |
2 |
|||
|
8 |
5 |
|||
|
9 |
7 |
|||
Для выбора криопротекторов одинаковое ко- личество бактериального концентрата симбиоти- ческой закваски вносили в стеклянные флаконы, в которые затем вносили криопротекторы в раз- ных концентрациях. Замораживание проводили при –25 °С со скоростью охлаждения 100 °С. По- сле 24-часовой выдержки при –25 °С флаконы
размораживали в водяной бане при 37–40 °С. Из размороженных заквасок делали посевы мето- дом предельного разведения в питательные сре- ды для количественного учета термофильных, мезофильных лактобактерий, дрожжей, сбражи- вающих и не сбраживающих лактозу. Получен- ные результаты представлены в таблице 2.
Выживаемость клеток после замораживания
Таблица 2
|
Номер образца |
Количество микроорганизмов симбиотической закваски, КОЕ/см3 |
|||
|
Лактобактерии |
Дрожжи |
|||
|
термофильные |
мезофильные |
сбраживающие лактозу |
не сбраживающие лактозу |
|
|
Бакконцентрат до заморажи- вания |
8·1011 |
6·1010 |
7·109 |
9·1010 |
|
1 |
4·1010 |
7·109 |
2·108 |
4·108 |
|
2 |
2·1011 |
5·1010 |
1·109 |
5·1010 |
|
3 |
3·109 |
3·109 |
5·108 |
2·108 |
|
4 |
4·1011 |
1·1010 |
1·108 |
3·109 |
|
5 |
5·1011 |
5·1010 |
3·109 |
3·1010 |
|
6 |
3·1011 |
3·1010 |
5·109 |
5·1010 |
|
7 |
7·108 |
3·107 |
5·103 |
1·104 |
|
8 |
3·1010 |
8·109 |
4·105 |
2·106 |
|
9 |
2·1011 |
5·1010 |
3·108 |
6·109 |
Из таблицы 2 видно, что присутствие 5 % гли- церина и более 5 % желатина в защитной среде благотворно влияет на выживаемость дрожжей, наиболее уязвимых к замораживанию, и молоч- нокислых бактерий. Кроме этого, в указанных образцах сохраняется исходное количественное соотношение основных групп микроорганизмов симбиотической закваски.
Для оценки ферментативной активности об- разцов 2 и 5 проводили культивирование на пасте-
ризованном охлажденном до 30 °С обезжиренном молоке. Для сквашивания вносили 1 ед. закваски (из расчета 25 мл на 100 кг молока). В качестве контроля использовали кисломолочный продукт курунга, полученный сквашиванием обезжирен- ного молока жидкой пересадочной закваской. Результаты оценки качественных показателей об- разцов представлены в таблице 3.
Качественная оценка ферментативной активности образцов
Таблица 3
|
Показатель |
Контроль |
Образец 2 |
Образец 5 |
|
Органолептические показатели |
Вкус кисломолочный, с дрожжевым привкусом, консистенция жидкая, хлопьевидная, слегка газированная |
||
|
Активная кислотность, рН |
3,6+0,1 |
3,6 |
3,6 |
|
Титруемая кислотность, °Т |
200–220 |
202 |
204 |
|
Продолжительность, ч |
14–15 |
12 |
14 |
|
Количество жизнеспособных микроорганизмов, КОЕ/см3: |
|||
|
термофильные лактобактерии |
106 |
108 |
108 |
|
мезофильные лактобактерии |
109 |
109 |
109 |
|
дрожжи, сбраживающие лактозу |
107 |
105 |
104 |
|
дрожжи, не сбраживающие лактозу |
105 |
105 |
105 |
Из таблицы 3 видно, что наибольшей фер- ментативной активностью обладает образец, где в качестве криопротектора использовали глице- рин. Вероятно, это связано с тем, что глицерин обладает смешанным эффектом действия – эндо-экстрацеллюлярным [6]. Применение замо- роженного концентрата на 2 часа ускоряет про- должительность сквашивания молока до рН 3,6 в сравнении с контролем.
Выводы. Установлено, что защитная среда, содержащая 5 % глицерина, обеспечивает вы- сокий уровень выживаемости микроорганизмов закваски при замораживании и обеспечивает сохранение исходного количественного соотно- шения основных групп микроорганизмов бакте- риального концентрата.
Ферментативная активность бактериального концентрата, замороженного в защитной среде с 5 % глицерина, превосходит пересадочную жид- кую курунговую закваску на 2–3 ч.
1. Грачева И.В. и др. Традиционные и новые защитные среды для низкотемпературной консервации бактерий // Проблемы особо опасных инфекций. 2011. Вып. 110. С. 36–40.
2. Занданова Т.Н., Гоголева П.А. Исследование биотехнологического потенциала микробного консорциума // Вестник ВСГУТУ. 2017. № 3 (66). С. 71–77.
3. Занданова Т.Н., Лосорова Ю.Е., Мырьянова Т.П. Исследование возможности получения ассоциативной закваски для производства курунги // Вестник КрасГАУ. 2020. № 9. С. 185– 192.
4. Королева Н.С., Пятницына И.Н., Банникова Л.А. Способ приготовления сухих заква- сок // Молочная промышленность. 1984. № 5. С. 27–29.
5. Котлов С.А. Оптимизация криопротекто- ров для лиофилизации вакцинных штаммов Salmonella // Биологический журнал. 2019. № 5. URL: https://bio-j.ru/journal/bio-j/2019/06/ articles/124.pdf.
6. Кригер О.В., Носкова С.Ю. Разработка прие- мов длительного сохранения свойств молоч- нокислых микроорганизмов // Техника и техно- логия пищевых производств. 2018. Т. 49, № 4. С. 30–37.
7. Куплетская М.Б., Нетроусов А.И. Жизнеспо- собность лиофилизированных микроорганиз- мов после 50 лет хранения // Микробиология. 2011. Т. 80, № 6. С. 842–846.
8. Перфильева Г.Д., Гудкова А.В., Шергин Н.А., Сорокина Н.П. Производство и применение бактериальных заквасок и препаратов в сыроделии. М.: Изд-во ЦНИИТЭИмясомолпром, 1985. 36 с.
9. Фролова М.Д. Особенности разработки лио- филизированных заквасок // Молочная про- мышленность. 2008. № 6. С. 70–71.
10. Харитонов Д.В. Некоторые особенности за- мораживания микроорганизмов в среде жид- кого азота // Научное обеспечение молочной промышленности (ВНИМИ–80): сб. науч. тр. М.: Изд-во ВНИМИ, 2009. С. 393–397.
11. Feltham R.K.A., PowerA.K., Pell P.A., Sneath P.H.A. A simple method for the storage of bacteria at –70 °C. J. Appl. Bacteriol. 1978; 44:313–6.
12. Sukhikh S. A., Krumlikov V.Y., Evsukova A.O. et al. Formation and study of symbiotic consortium of lactobacilli to receive a direct application starter // Foods and Raw Materials. 2017. Vol. 5, № 1. P. 51–62. DOI:https://doi.org/10.21179/2308-4057-2017-1-51-62.
