Yakutsk, Russian Federation
The aim of the reseach is to study the effect of cryprotectors of various compositions on the preservation of the microflora of the bacterial concentrate of the symbiotic starter culture in the course of freezing. Re- search objectives are: selection of the type and dose of cryoprotectant for freezing the symbiotic bacterial concentrate; assessment of the level of survival of viable cells; study of the enzymatic activity of frozen bac- terial concentrate. The bacterial concentrate microflora is identical to the natural ferment for the production of kurunga. The object of the research was the cryprotectors glycerin, sucrose, gelatin - substances that pre- vent water crystallization; bacterial concentrate of symbiotic kurung starter culture. A nutrient medium with buffer salts was used as a base mixture. Standard and generally accepted research methods were used. Titratable acidity was according to GOST 3624 by titration with 0.1 n. sodium hydroxide solution with phenolphthalein. The value of active acidity was according to GOST P 53359-2009 by potentiometric method on an Anion-7000 device. The effect of cryoprotectants on the preservation of the viability of microorganisms of the bacterial concentrate of the symbiotic starter culture was examined by freezing in a freezer to –25 °C at a cooling rate of 100 °C per minute. The effectiveness of cryoprotectants was assessed by the number of viable cells of the main groups of microorganisms in the starter culture and the enzymatic activity of the thawed bacterial concentrate. The results obtained showed that the use of 5 % glycerol and gelatin over 5% in the composition of the protective medium retains the original properties of the bacterial concentrate and promotes the survival of yeast cells. The use of sucrose ensures the preservation of only lactobacilli. The study of the enzymatic activity reveals that the bacterial concentrate, frozen in a protective environment with 5 % glycerin, ferments milk within 10–12 hours. The high level of restoration of the starter culture activity is associated with the endo – and extracellular properties of glycerin.
symbiotic starter culture, kurunga, protective environment, glycerin, gelatin, sucrose, bacte- rial concentrate, conservation, freezing, cell survival.
Введение. При производстве бактериальных концентратов важнейшей задачей является со- хранение качественных показателей в течение длительного времени. Наиболее распространен- ным способом консервирования бактериальных концентратов является замораживание и лиофи- лизация [4, 6, 9, 12]. Для защиты микроорганиз- мов от криоповреждений применяют защитные среды [6, 9]. Растворы «истинных» криопротек- торов при замораживании способствуют форми- рованию так называемого стекловидного льда, в то время как соединения, неспособные к протек- торному эффекту, образуют гексагональные кри- сталлы [6, 10]. Скорость образования льда, как известно, во многом зависит от способности того или иного вещества образовывать водородные связи – чем выше это свойство, тем быстрее сни- жается скорость роста кристаллов льда. Соеди- нения, обладающие способностью образовывать большое количество водородных связей с жид- кой фазой, проявляют защитные свойства. Такое свойство этих соединений способствует умень- шению количества способной к кристаллизации воды в клетке и изменению характера самой кристаллизации. Защитные вещества, связыва- ющие водород до определенной степени, могут стабилизировать поверхностную гидратацию клетки за счет упрочнения гидратационных ре- шеток, окружающих клетки, что уменьшает воз- можность их повреждения при замораживании [8, 9]. Эффективный криопротектор должен быть нетоксичным, при этом он должен поддерживать в растворенном состоянии соли и белки вплоть до эвтектического перехода в аморфное состоя- ние, то есть его растворы должны иметь низкую эвтектическую температуру, чтобы сократить температурный интервал воздействия твердой фазы на структуру вещества в процессе замо- раживания и отогрева. Для низкотемпературной консервации бактерий чаще всего используют
глицерин в концентрациях 5–25 % в составе во- дных растворов, жидких питательных сред, в со- четании с другими криозащитными веществами [1]. Лучшей средой для консервации бактерий, имеющих медицинское значение, по сообщению
R.K.A. Feltham с соавторами, является бульон Oxoid с 10 % глицерина. Выживаемость бактерий составляет 67–100 % [1, 11].
Из углеводов для хранения бактерий при низ- ких температурах используют глюкозу, сахарозу, лактозу, трегалозу в концентрациях 5–15 %. Счи- тается, что углеводы обладают менее выражен- ными криозащитными свойствами, чем глицерин, поэтому их рекомендуют применять в сочетании с другими протекторами. Однако было установлено, что протекторное действие сахарозы сопоставимо с глицерином для криоконсервации P. putida, E. coli и B. Thuringiensis [1]. Сахара, проникая в клетку и создавая там осмотическое давление, препят- ствуют образованию кристаллов льда и разруше- нию клетки в процессе замораживания [1, 5].
Среды, в которых в качестве коллоида вводит- ся желатин и агар-агар, нашли широкое примене- ние при производстве сухих живых вакцин, так как они лишены антигенных свойств. Наиболее часто применяемая доза желатина в защитных средах составляет 1–2 % [6, 7, 12]. Желатин увеличива- ет стабилизирующее действие среды и позволяет хранить высушенные культуры без создания ва- куума, не проникает в клетку, но заставляет кле- точную оболочку плотнее прилегать к цитоплазме, что важно при размораживании [5, 7].
Цель исследования: изучение влияния кри- протекторов различного состава на сохранение микрофлоры бактериального концентрата сим- биотической закваски при замораживании.
В связи с поставленной целью в работе реша- лись следующие задачи:
-
выбор вида и дозы криопротектора для за- мораживания симбиотического бактериального концентрата;
-
оценка уровня выживаемости жизнеспособ- ных клеток;
-
исследование ферментативной активности замороженного бактериального концентрата.
Объект и методы исследования. Объектом исследования были крипротекторы глицерин, сахароза, желатин; бактериальный концентрат симбиотической курунговой закваски [2, 3].
Использовали стандартные и общепринятые методы исследования. Титруемая кислотность – по ГОСТ 3624 титрованием 0,1 н. раствором едкого натра с фенолфталеином, выражается в градусах Тернера. Величина активной кислотно- сти – по ГОСТ Р 53359-2009 потенциометриче- ским методом на приборе Анион-7000.
Исследовали влияние криопротекторов на со- хранение жизнеспособности микроорганизмов бактериального концентрата симбиотической закваски замораживанием в морозильной каме- ре до –25 °С со скоростью охлаждения 100 °С в минуту. В качестве базовой смеси использовали свежую питательную среду с буферными соля- ми. Выживаемость клеток после замораживания оценивали по количествy жизнеспособных бакте-
рий относительно количества микроорганизмов в бактериальном концентрате до замораживания. Количество микроорганизмов оценивали методом предельных разведений на среде МRS культиви- рованием: термофильные лактобактерии – при 42 °С; мезофильные лактобактерии – при 30 °С.
Для определения количества жизнеспособ- ных клеток дрожжей использовали следующие среды:
-
дрожжи, сбраживающие лактозу, на карто- фельно-лактозной среде культивированием при 30 °С;
-
дрожжи, не сбраживающие лактозу, на кар- тофельно-глюкозной среде культивированием при 30 °С.
Результаты исследования и их обсужде- ние. При замораживании большое внимание уделяется составу защитных сред, обеспечива- ющих внутри- и внеклеточную защиту при замо- раживании. В качестве криопротекторов были использованы следующие вещества: глицерин, сахароза, желатин, – широко применяемые для консервирования микроорганизмов и обеспечи- вающие их высокую выживаемость [1, 4, 5, 7, 11]. В таблице 1 представлены характеристики об- разцов, использованных для исследования.
Содержание криопротекторов в защитной среде
Таблица 1
|
Номер образца |
Количество криопротектора, % |
|||
|
Глицерин |
Желатин |
Сахароза |
||
|
1 |
2 |
– |
– |
|
|
2 |
5 |
|||
|
3 |
7 |
|||
|
4 |
2 |
|||
|
5 |
5 |
|||
|
6 |
7 |
|||
|
7 |
2 |
|||
|
8 |
5 |
|||
|
9 |
7 |
|||
Для выбора криопротекторов одинаковое ко- личество бактериального концентрата симбиоти- ческой закваски вносили в стеклянные флаконы, в которые затем вносили криопротекторы в раз- ных концентрациях. Замораживание проводили при –25 °С со скоростью охлаждения 100 °С. По- сле 24-часовой выдержки при –25 °С флаконы
размораживали в водяной бане при 37–40 °С. Из размороженных заквасок делали посевы мето- дом предельного разведения в питательные сре- ды для количественного учета термофильных, мезофильных лактобактерий, дрожжей, сбражи- вающих и не сбраживающих лактозу. Получен- ные результаты представлены в таблице 2.
Выживаемость клеток после замораживания
Таблица 2
|
Номер образца |
Количество микроорганизмов симбиотической закваски, КОЕ/см3 |
|||
|
Лактобактерии |
Дрожжи |
|||
|
термофильные |
мезофильные |
сбраживающие лактозу |
не сбраживающие лактозу |
|
|
Бакконцентрат до заморажи- вания |
8·1011 |
6·1010 |
7·109 |
9·1010 |
|
1 |
4·1010 |
7·109 |
2·108 |
4·108 |
|
2 |
2·1011 |
5·1010 |
1·109 |
5·1010 |
|
3 |
3·109 |
3·109 |
5·108 |
2·108 |
|
4 |
4·1011 |
1·1010 |
1·108 |
3·109 |
|
5 |
5·1011 |
5·1010 |
3·109 |
3·1010 |
|
6 |
3·1011 |
3·1010 |
5·109 |
5·1010 |
|
7 |
7·108 |
3·107 |
5·103 |
1·104 |
|
8 |
3·1010 |
8·109 |
4·105 |
2·106 |
|
9 |
2·1011 |
5·1010 |
3·108 |
6·109 |
Из таблицы 2 видно, что присутствие 5 % гли- церина и более 5 % желатина в защитной среде благотворно влияет на выживаемость дрожжей, наиболее уязвимых к замораживанию, и молоч- нокислых бактерий. Кроме этого, в указанных образцах сохраняется исходное количественное соотношение основных групп микроорганизмов симбиотической закваски.
Для оценки ферментативной активности об- разцов 2 и 5 проводили культивирование на пасте-
ризованном охлажденном до 30 °С обезжиренном молоке. Для сквашивания вносили 1 ед. закваски (из расчета 25 мл на 100 кг молока). В качестве контроля использовали кисломолочный продукт курунга, полученный сквашиванием обезжирен- ного молока жидкой пересадочной закваской. Результаты оценки качественных показателей об- разцов представлены в таблице 3.
Качественная оценка ферментативной активности образцов
Таблица 3
|
Показатель |
Контроль |
Образец 2 |
Образец 5 |
|
Органолептические показатели |
Вкус кисломолочный, с дрожжевым привкусом, консистенция жидкая, хлопьевидная, слегка газированная |
||
|
Активная кислотность, рН |
3,6+0,1 |
3,6 |
3,6 |
|
Титруемая кислотность, °Т |
200–220 |
202 |
204 |
|
Продолжительность, ч |
14–15 |
12 |
14 |
|
Количество жизнеспособных микроорганизмов, КОЕ/см3: |
|||
|
термофильные лактобактерии |
106 |
108 |
108 |
|
мезофильные лактобактерии |
109 |
109 |
109 |
|
дрожжи, сбраживающие лактозу |
107 |
105 |
104 |
|
дрожжи, не сбраживающие лактозу |
105 |
105 |
105 |
Из таблицы 3 видно, что наибольшей фер- ментативной активностью обладает образец, где в качестве криопротектора использовали глице- рин. Вероятно, это связано с тем, что глицерин обладает смешанным эффектом действия – эндо-экстрацеллюлярным [6]. Применение замо- роженного концентрата на 2 часа ускоряет про- должительность сквашивания молока до рН 3,6 в сравнении с контролем.
Выводы. Установлено, что защитная среда, содержащая 5 % глицерина, обеспечивает вы- сокий уровень выживаемости микроорганизмов закваски при замораживании и обеспечивает сохранение исходного количественного соотно- шения основных групп микроорганизмов бакте- риального концентрата.
Ферментативная активность бактериального концентрата, замороженного в защитной среде с 5 % глицерина, превосходит пересадочную жид- кую курунговую закваску на 2–3 ч.
1. Gracheva I.V. i dr. Tradicionnye i novye zaschitnye sredy dlya nizkotemperaturnoy konservacii bakteriy // Problemy osobo opasnyh infekciy. 2011. Vyp. 110. S. 36–40.
2. Zandanova T.N., Gogoleva P.A. Issledovanie biotehnologicheskogo potenciala mikrobnogo konsorciuma // Vestnik VSGUTU. 2017. № 3 (66). S. 71–77.
3. Zandanova T.N., Losorova Yu.E., Myr'yanova T.P. Issledovanie vozmozhnosti polucheniya associativnoy zakvaski dlya proizvodstva kurungi // Vestnik KrasGAU. 2020. № 9. S. 185– 192.
4. Koroleva N.S., Pyatnicyna I.N., Bannikova L.A. Sposob prigotovleniya suhih zakva- sok // Molochnaya promyshlennost'. 1984. № 5. S. 27–29.
5. Kotlov S.A. Optimizaciya krioprotekto- rov dlya liofilizacii vakcinnyh shtammov Salmonella // Biologicheskiy zhurnal. 2019. № 5. URL: https://bio-j.ru/journal/bio-j/2019/06/ articles/124.pdf.
6. Kriger O.V., Noskova S.Yu. Razrabotka prie- mov dlitel'nogo sohraneniya svoystv moloch- nokislyh mikroorganizmov // Tehnika i tehno- logiya pischevyh proizvodstv. 2018. T. 49, № 4. S. 30–37.
7. Kupletskaya M.B., Netrousov A.I. Zhiznespo- sobnost' liofilizirovannyh mikroorganiz- mov posle 50 let hraneniya // Mikrobiologiya. 2011. T. 80, № 6. S. 842–846.
8. Perfil'eva G.D., Gudkova A.V., Shergin N.A., Sorokina N.P. Proizvodstvo i primenenie bakterial'nyh zakvasok i preparatov v syrodelii. M.: Izd-vo CNIITEImyasomolprom, 1985. 36 s.
9. Frolova M.D. Osobennosti razrabotki lio- filizirovannyh zakvasok // Molochnaya pro- myshlennost'. 2008. № 6. S. 70–71.
10. Haritonov D.V. Nekotorye osobennosti za- morazhivaniya mikroorganizmov v srede zhid- kogo azota // Nauchnoe obespechenie molochnoy promyshlennosti (VNIMI–80): sb. nauch. tr. M.: Izd-vo VNIMI, 2009. S. 393–397.
11. Feltham R.K.A., PowerA.K., Pell P.A., Sneath P.H.A. A simple method for the storage of bacteria at –70 °C. J. Appl. Bacteriol. 1978; 44:313–6.
12. Sukhikh S. A., Krumlikov V.Y., Evsukova A.O. et al. Formation and study of symbiotic consortium of lactobacilli to receive a direct application starter // Foods and Raw Materials. 2017. Vol. 5, № 1. P. 51–62. DOI:https://doi.org/10.21179/2308-4057-2017-1-51-62.
