The goal of the research is to work out the methods for the specific diagnostics of nodular dermatitis using diagnostic smallpox in sheep. Research objectives is to conduct studies that determine the possibility of diagnostics nodular dermatitis of cattle using the means and methods for diagnostics smallpox in sheep. The study objects were as follows: cattle skin with the clinical signs of nodular dermatitis; good-doers’ skin; blood serum of ill and recovered cattle; blood serum of good-doers; sets of diagnostic agents for comple- ment fixation test and diffuse precipitation reaction of smallpox in sheep produced by the Research Institute for Biological Safety Problems (Gvardeysky urban-type settlement of Zhambyl Region, Kazakhstan). In total 32 samples of blood serum from sick and healthy animals with antigen of virussmallpox in sheep and 12 samples of organ tissue material were examined. All reactions for statistical processing were performed in five variants. The test material from cattle with the clinical signs of the nodular dermatitis was obtained at the regional veterinary station of Aksu city, Pavlodar Region. As a result of the research, it was found that nodular dermatitis disease is a relatively new and not typical for Kazakhstan infectious disease of cattle. Consequently, studies have found that in the reactions of diffusion deposition and component fixation with the use of the sets of diagnostic agents for smallpox in sheep, the antigenic relationship between nodular virus of cattle and virus in smallpox was proved. Means and methods of laboratory diagnostics of smallpox in sheep can be used for intravital and postmortem diagnostics of nodular dermatitis of cattle with a high degree of efficiency and reliability.
cattle, nodular dermatitis, exotic trans-boundary disease, spread, convalescents, diagnostics, blood serum, antigen, serological reactions, smallpox in sheep, set of diagnostic agents.
Введение. Распространение различных бо- лезней животных в Казахстане является одной из наиболее актуальных проблем животновод- ства республики. Болезни представляют угрозу не только для продуктивности животных, но и для жизни животных в целом [1].
Инфекционный узелковый дерматит – это трансмиссивное заболевание крупного рогатого скота и азиатских буйволов, которое характе- ризуется поражением кожи в виде узелков. Эта болезнь эндемична по всей Африке и Ближнему Востоку, а с 2015 г. она распространилась на Балканы, Кавказ, юг Российской Федерации, где болезнь продолжает распространяться, несмо- тря на принятые меры по ее профилактике [2, 3]. Новые вспышки нодулярного дерматита в России были зафиксированы 25 мая 2016 г. в Краснодарском крае. С 29 мая по 12 июня в Ре- спублике Дагестан было найдено 15 очагов забо- левания, где они были обнаружены на фермах, в которых содержалось в общей сложности 360
645 животных [4].
Первые случаи нодулярното дерматита КРС в Казахстане были зафиксированы в 2016 г. на западе страны. 7 тысяч животных заболели, из них 1 150 умерли. Вирусный нодулярный дерма- тит был выявлен в Костанайской, Акмолинской, Северо-Казахстанской и Павлодарской областях. В 2017 г., благодаря усилиям ветеринарных служб, новых вспышек в регионах удалось избе-
жать. Однако новые очаги болезни появились в других регионах страны.
С 2016 по 2018 г. нодулярным дерматитом было поражено большое поголовье КРС и выяв- лено много очагов заболевания, которые начали распространяться из мест первичных вспышек на границах республики вглубь страны [5].
Нодулярный дерматит – это экзотическое трансграничное заболевание, согласно клас- сификации Международного эпизоотического бюро, оно относится к первой группе особо опас- ных заболеваний, наряду с сибирской язвой и бе- шенством, и характеризуется как экономически и социально значимое заболевание. Передача ви- русной инфекции осуществляется кровососущи- ми насекомыми, но она также может распростра- няться и через потребление зараженных кормов или воды, прямым контактом с животными, спа- риванием или искусственным осеменением [6].
Антигенные свойства, родство и изменчи- вость вируса нодулярного дерматита изучены не полностью. Антигенно вирус связан с вирусом оспы овец и, возможно, вирусом оспы козы.
При культивировании вируса нодулярного дерматита используются первичные культуры клеток органов ягнят, детей и телят.
Для диагностики вируса нодулярного дерма- тита в настоящее время используются вироско- пия, твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), реакция иммунофлуоресценции, реакция иммунодиффузии в агаровом геле, полимераз-
ная цепная реакция (ПЦР), реакция нейтрали- зации и непрямые флуоресцентные антитела; выделение вируса путем заражения культуры клеток и его обнаружение с помощью электрон- ной микроскопии; а также постановка биоанализа на естественно восприимчивых животных.
Нодулярный дерматит является относитель- но новой болезнью, требующей разработки ме- тодов диагностики, поэтому изучение возмож- ности диагностировать заболевание с помощью серологических методов диагностики оспы овец является актуальным на сегодняшний день [7, 8]. Из-за сложной эпизоотической ситуации и угрозы дальнейшего распространения нодуляр- ного дерматита на территории Республики Ка- захстан актуальной задачей является изучение биологических свойств возбудителя с целью раз- работки высокоэффективных диагностических препаратов и специфических профилактических средств, а также использование серологической диагностики оспы овец с помощью РСК, РДСК, РДП, так как они антигенно связаны с нодуляр- ным дерматитом КРС, что позволило бы в корот- кие сроки выявить возбудителя и быстро остано-
вить распространение инфекции.
Цель исследования: разработка методов специфической диагностики нодулярного дерма- тита с применением диагностикума оспы овец.
Задачи исследования: провести исследо- вания, определяющие возможность диагностики нодулярного дерматита КРС при использовании средств и методов диагностики оспы овец.
Объекты и методы исследования. Объекты исследования – кожа КРС с клиническими при- знаками нодулярного дерматита; кожа здорового КРС; сыворотка крови больного и переболев- шего нодулярным дерматитом КРС; сыворотка крови здоровых животных; наборы диагности- кумов для РСК и РДП при оспе овец производ- ства НИИ проблем биологической безопасности (пгт. Гвардейский Жамбылской области Респуб- лики Казахстан).
Исследуемый материал от КРС с клиничес- кими признаками нодулярного дерматита (кожа и сыворотка крови переболевших животных) был получен в районной ветеринарной станции г. Аксу Павлодарской области. Для контроля специфичности метода использовали материал, полученный в районной ветеринарной стан- ции г. Аксу Павлодарской области от здоровых животных и животных с проявлением сходных клинических признаков поражения кожи, но без положительной реакции по вирусоскопии. Здесь же для прижизненной диагностики у больных
животных были взяты образцы сыворотки кро- ви на разных стадиях инфекционного процесса (начальный период, выраженные признаки забо- левания, выздоровление).
Всего исследовано 32 пробы сыворотки крови больных и здоровых животных с антигеном ви- руса оспы овец и 12 проб органотканевого мате- риала. Все реакции для статистической обработ- ки проводили в пяти вариантах.
В процессе исследования применяли методы вирусоскопии (окраска по методу А.М. Морозова, 1925); РСК в модификации длительного связы- вания комплемента; РДП по методу Оухтерлони, используя 1 % агар Difco, поддерживая реакцию при температуре (37±1) °C в течение двадцати четырех часов.
Для получения образцов сыворотки крови отбор производился в стерильные пробирки, которые помещали в термостат при темпера- туре (37±1) °С на три-четыре часа. После от- деления сыворотки ее разливали в отдельные стерильные пробирки, при необходимости цен- трифугировали для осаждения клеток крови и использовали в серологических реакциях для обнаружения антител.
Для исследования в серологических реакциях на обнаружение вирусного антигена нодулярного дерматита КРС использовали участки поражен- ной кожи, из проб которых была приготовлена 20 % суспензия в физиологическом растворе, которую однократно замораживали и оттаива- ли, центрифугировали при 4000–5000 об/мин в течение 30 мин и супернатант использовали для исследования.
Результат РСК считали положительным, если в двух пробирках с последовательными разведе- ниями испытуемого материала (сыворотки или органотканевого антигена) была полная (задерж- ка гемолиза 100 %) или выраженная задержка ге- молиза, по меньшей мере, на 2 креста в каждой пробирке (гемолиз 50 %) или более выраженная (25–0 % гемолиз). За титр испытуемого мате- риала в этом случае принимали последнее его разведение, вызывающее задержку гемолиза на 50 % и более.
Результат РДП в агаровом геле по методу Оухтерлони считался положительным, если между лунками с исследуемым материалом (ор- ганотканевой материал или сыворотка крови) и диагностическим препаратом образовались визуально заметные полосы преципитации. По- следнее разведение испытуемого материала, вызывающее проявление линии преципитации, принимали за его титр [9].
При исследовании сыворотки крови диагности- ческие антигены вируса оспы овец вводили в цен- тральные лунки в разведении 1 : 2, в перифериче- ских исследуемая сыворотка крови была интактной. При постановке реакции для проверки специ- фичности и активности диагностических препа- ратов делали постановку контрольных проб от
здоровых животных.
Серологические реакции РДСК, РДП были использованы для определения специфической активности сыворотки крови животных, а также для выявления и количественного определения специфических антигенов вируса нодулярного дерматита КРС в коже больных животных.
В количественной версии РДСК и РДП иссле- дуемый материал использовали в виде суспен- зии пораженных участков кожи в разведениях от 1 : 2 до 1 : 24, либо сыворотки в разведениях от цельного до 1 : 32, реакции проводили с соот- ветствующими специфическими и контрольными нормальными диагностическими препаратами,
взятыми в рабочем разведении, и комплементом с использованием его четырехкратного предель- ного титра в гемолитической системе.
В качественном варианте РДСК и РДП иссле- дуемый материал использовали в разведении 1 : 2. Статистическую обработку полученных дан- ных проводили разностным методом Стьюдента,
описанным В.А. Чистяковым [10].
Результаты исследования и их обсужде- ние. Как видно из данных, представленных в таблице 1, вирус-специфические антитела, свя- занные с антигеном вируса Sheeppox, были об- наружены в сыворотке крови больных животных в разные периоды заболевания. Так, у животных с выраженными клиническими признаками – в титрах до 1 : 8 в РДСК и в разведениях до 1 : 2 в РДП. У переболевших животных он составил в РДСК до 1 : 16 и РДП до 1 : 4.
Сыворотка крови от животных с другими забо- леваниями и сыворотка крови от здорового скота показали отрицательную реакцию.
Таблица 1
Результаты серологических реакций при исследовании проб сыворотки крови больного КРС с антигеном вируса оспы овец
|
Испытуемые сыворотки крови от животных |
Кол-во проб |
Антиген вируса оспы овец |
|
|
РДСК |
РДП |
||
|
С выраженными клиническими признаками |
12 |
1 : 2–1 : 8 |
Ц–1 : 2 |
|
Выздоровевших (реконвалесцентов) |
4 |
1 : 4–1 : 16 |
1 : 2–1 : 4 |
|
Больных дерматитом без положительной вирусоскопии |
10 |
– |
– |
|
Здоровых |
6 |
– |
– |
Из данных таблицы 2 видно, что при использо- вании специфической сыворотки для вируса оспы овец антигены нодулярного дерматита КРС были обнаружены в образцах кожи в титрах от целого до 1 : 8 в РДСК и в разведениях до 1 : 4 в РДП.
Исследования по контролю специфичности препаратов кожи КРС, полученных от здоровых и больных животных с другими кожными заболева- ниями, показали отрицательный результат.
Таблица 2
Результаты исследования в РДСК и РДП проб органотканевого материала у КРС
|
Органотканевой материал |
Кол-во проб |
Сыворотка к оспе овец |
|
|
РДСК |
РДП |
||
|
Подтвержденный вирусоскопией на наличие оспоподобного вируса |
4 |
1 : 4–1 : 8 |
1 : 2–1 : 4 |
|
С отрицательной вирусоскопией |
4 |
– |
– |
|
Контроль (материал от здоровых животных) |
4 |
– |
– |
В результате проведенных исследований было установлено, что серологические реакции на нодулярный дерматит у КРС могут быть вы- полнены с использованием средств и методов диагностики оспы овец.
Прямая диагностика
На основании проведенного исследования ниже предлагается схема прямой и ретроспек- тивной серологической диагностики нодулярного дерматита КРС (рис.).
Ретроспективная диагностика
Нодулярный дерматит
не подтвержден
Отрицательный результат
РДСК, РДП
с использованием
вируса оспы овец
|
Вирусоскопия по Морозову |
|
Положительный результат
РДСК, РДП
Положительный результат (диагноз на НД КРС
подтвержден)
Отрицательный результат (диагноз на НД КРС
не подтвержден)
с использованием диагностического антигена вируса оспы овец
Положительный результат
Отрицательный результат
Диагноз подтвержден
Диагноз
не подтвержден
Противоэпизоотические мероприятия
Схема прямой и ретроспективной серологической диагностики нодулярного дерматита КРС
Для прямой диагностики (обнаружения вирус- ного антигена) в качестве проб патологического материала необходимо использовать кусочки по- раженной кожи КРС.
На первом этапе готовят мазок-отпечаток из пораженной кожи на участке, граничащем со здо- ровой кожей. Мазок окрашивают по методу сере- брения по А.М. Морозову.
При отрицательном результате вирусоскопии по А.М. Морозову проводят дальнейшую диагно- стику на наличие других заразных или незараз- ных заболеваний, вызывающих дерматиты.
При положительном результате вирусоскопии из участков пораженной кожи готовят суспензию на физиологическом растворе, которую иссле- дуют методами РДСК и РДП с использованием специфических диагностических сывороток при оспе овец. При положительном результате диа- гноз на нодулярный дерматит КРС считают уста- новленным.
Для ретроспективной диагностики нодуляр- ного дерматита КРС отбирают сыворотки крови от больных и переболевших животных, которые исследуют методами РДСК и РДП с использо- ванием диагностических антигенов, взятых из наборов для диагностики при оспе овец. Положи- тельный результат серологических реакций сви- детельствует о болезни или переболевании КРС нодулярным дерматитом.
Этот метод в настоящее время рекомендует- ся для индикативной и дифференциальной диа- гностики нодулярного дерматита КРС. С этой це- лью предлагается к практическому применению для КРС использование разработанной схемы прямой и ретроспективной серологической диа- гностики заболевания.
Выводы. Нодулярный дерматит является от- носительно новым и не типичным для Казахста- на инфекционным заболеванием КРС.
В реакциях диффузионного осаждения и свя- зывания комплемента с использованием диа- гностических наборов для оспы овец была под- тверждена антигенная связь между нодулярным вирусом КРС и вирусом оспы овец.
Средства и методы лабораторной диагно- стики оспы овец могут быть использованы для прижизненной и посмертной диагностики ноду- лярного дерматита КРС с высокой степенью эф- фективности и надежности.
1. Respublika Kazahstan. O gosudarstvennom regulirovanii razvitiya agropromyshlenno- go kompleksa i sel'skih territoriy: zakon ot 8 iyulya 2005 g. № 66-III ZRK // Kazahstanskaya pravda. 2005. 12 iyulya.
2. Şevik M. Epidemiological and Molecular Studies on Lumpy Skin Disease Outbreaks in Turkey during 2014–2015 // Transbound Emerg Dis. 2016. Vol. 64, № 4. R. 6.
3. Saegerman C. Risk of introduction of Lumpy Skin Disease into France through imports of cattle // Transbound Emerg Dis. 2019. Vol. 66, № 2. R. 40.
4. Mischenko A.V., Mischenko V.A. Epizootiche- skaya situaciya po transgranichnym i ekono- micheski znachimym infekcionnym boleznyam KRS v Rossii v 2013–2014 gg. // H Baltiy- skiy forum veterinarnoy mediciny i pro- dovol'stvennoy bezopasnosti: tez. konf (Sankt-Peterburg, 18–20 sentyabrya 2014 g.). SPb., 2014. S. 165–167.
5. Obespechenie veterinarnoy bezopasnosti v hozyaystvah – chlenah respublikanskoy Palaty kazahskoy belogolovoy porody / sost. A.A. Suminov, A.Yu. Mal'chevskiy. Astana, 2015. 54 s.
6. Kosareva O.A., Kukushkina M.S., Konstanti- nov A.V. i dr. Nodulyarnyy dermatit (bugor- chatka), klinicheskie priznaki pri eksperimen- tal'nom zarazhenii krupnogo rogatogo skota // Trudy Federal'nogo centra ohrany zdorov'ya zhivotnyh. Vladimir, 2010. T. 8. S. 73–83.
7. Orlova E.S. Sovershenstvovanie metodov diagnostiki ospy ovec i ospy koz: avtoref. … dis. kand. biol. nauk. Vladimir, 2007. 23 s.
8. Kulyk I.I., Nikitin E.B. Geterologichnaya serologicheskaya diagnostika nodulyarnogo dermatita krupnogo rogatogo skota // Mat-ly V Mezhdunar. nauch.-prakt. konf. Pavlodar, 2020. S. 246–249.
9. Syurin V.N. Rukovodstvo po veterinarnoy vi-rusologi. M.: Kolos, 1966. S. 55–76.
10. Ivchenko G.I., Medvedev Yu.I., Chistyakov A.V. Zadachi s resheniyami po matematicheskoy sta- tistike. M.: Drofa, 2007. 318 s.
