Цель исследования – разработка методов специфической диагностики нодулярного дерма- тита с применением диагностикума оспы овец. Задачи исследования: определить возможность диагностики нодулярного дерматита крупного рогатого скота (КРС) при использовании средств и методов диагностики оспы овец. Объекты исследования – кожа КРС с клиническими признаками нодулярного дерматита; кожа здоровых животных; сыворотка крови больного и переболевшего скота; сыворотка крови здоровых животных; наборы диагностикумов для РСК и РДП при оспе овец производства НИИ проблем биологической безопасности (пгт. Гвардейский Жамбылской об- ласти, Казахстан). Всего исследовано 32 пробы сыворотки крови больных и здоровых животных и 12 проб органотканевого материала с антигеном вируса оспы овец. Все реакции для статисти- ческой обработки проводили в пяти вариантах. Исследуемый материал от КРС с клиническими признаками нодулярного дерматита и от здоровых животных и особей с проявлением сходных клинических признаков поражения кожи, но без положительной реакции по вирусоскопии, был полу- чен в районной ветеринарной станции г. Аксу Павлодарской области. В результате исследования было установлено, что нодулярный дерматит является относительно новым и не типичным для Казахстана инфекционным заболеванием КРС. В реакциях диффузионного осаждения и связыва- ния комплемента с использованием диагностических наборов для оспы овец была подтверждена антигенная связь между нодулярным вирусом КРС и вирусом оспы овец. Средства и методы ла- бораторной диагностики оспы овец могут быть использованы для прижизненной и посмертной диагностики нодулярного дерматита КРС с высокой степенью эффективности и надежности.
крупный рогатый скот, нодулярный дерматит, экзотическое трансгранич- ное заболевание, распространение, реконвалесценты, диагностика, сыворотка крови, антиген, серологические реакции, оспа овец, набор диагностикумов.
Введение. Распространение различных бо- лезней животных в Казахстане является одной из наиболее актуальных проблем животновод- ства республики. Болезни представляют угрозу не только для продуктивности животных, но и для жизни животных в целом [1].
Инфекционный узелковый дерматит – это трансмиссивное заболевание крупного рогатого скота и азиатских буйволов, которое характе- ризуется поражением кожи в виде узелков. Эта болезнь эндемична по всей Африке и Ближнему Востоку, а с 2015 г. она распространилась на Балканы, Кавказ, юг Российской Федерации, где болезнь продолжает распространяться, несмо- тря на принятые меры по ее профилактике [2, 3]. Новые вспышки нодулярного дерматита в России были зафиксированы 25 мая 2016 г. в Краснодарском крае. С 29 мая по 12 июня в Ре- спублике Дагестан было найдено 15 очагов забо- левания, где они были обнаружены на фермах, в которых содержалось в общей сложности 360
645 животных [4].
Первые случаи нодулярното дерматита КРС в Казахстане были зафиксированы в 2016 г. на западе страны. 7 тысяч животных заболели, из них 1 150 умерли. Вирусный нодулярный дерма- тит был выявлен в Костанайской, Акмолинской, Северо-Казахстанской и Павлодарской областях. В 2017 г., благодаря усилиям ветеринарных служб, новых вспышек в регионах удалось избе-
жать. Однако новые очаги болезни появились в других регионах страны.
С 2016 по 2018 г. нодулярным дерматитом было поражено большое поголовье КРС и выяв- лено много очагов заболевания, которые начали распространяться из мест первичных вспышек на границах республики вглубь страны [5].
Нодулярный дерматит – это экзотическое трансграничное заболевание, согласно клас- сификации Международного эпизоотического бюро, оно относится к первой группе особо опас- ных заболеваний, наряду с сибирской язвой и бе- шенством, и характеризуется как экономически и социально значимое заболевание. Передача ви- русной инфекции осуществляется кровососущи- ми насекомыми, но она также может распростра- няться и через потребление зараженных кормов или воды, прямым контактом с животными, спа- риванием или искусственным осеменением [6].
Антигенные свойства, родство и изменчи- вость вируса нодулярного дерматита изучены не полностью. Антигенно вирус связан с вирусом оспы овец и, возможно, вирусом оспы козы.
При культивировании вируса нодулярного дерматита используются первичные культуры клеток органов ягнят, детей и телят.
Для диагностики вируса нодулярного дерма- тита в настоящее время используются вироско- пия, твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), реакция иммунофлуоресценции, реакция иммунодиффузии в агаровом геле, полимераз-
ная цепная реакция (ПЦР), реакция нейтрали- зации и непрямые флуоресцентные антитела; выделение вируса путем заражения культуры клеток и его обнаружение с помощью электрон- ной микроскопии; а также постановка биоанализа на естественно восприимчивых животных.
Нодулярный дерматит является относитель- но новой болезнью, требующей разработки ме- тодов диагностики, поэтому изучение возмож- ности диагностировать заболевание с помощью серологических методов диагностики оспы овец является актуальным на сегодняшний день [7, 8]. Из-за сложной эпизоотической ситуации и угрозы дальнейшего распространения нодуляр- ного дерматита на территории Республики Ка- захстан актуальной задачей является изучение биологических свойств возбудителя с целью раз- работки высокоэффективных диагностических препаратов и специфических профилактических средств, а также использование серологической диагностики оспы овец с помощью РСК, РДСК, РДП, так как они антигенно связаны с нодуляр- ным дерматитом КРС, что позволило бы в корот- кие сроки выявить возбудителя и быстро остано-
вить распространение инфекции.
Цель исследования: разработка методов специфической диагностики нодулярного дерма- тита с применением диагностикума оспы овец.
Задачи исследования: провести исследо- вания, определяющие возможность диагностики нодулярного дерматита КРС при использовании средств и методов диагностики оспы овец.
Объекты и методы исследования. Объекты исследования – кожа КРС с клиническими при- знаками нодулярного дерматита; кожа здорового КРС; сыворотка крови больного и переболев- шего нодулярным дерматитом КРС; сыворотка крови здоровых животных; наборы диагности- кумов для РСК и РДП при оспе овец производ- ства НИИ проблем биологической безопасности (пгт. Гвардейский Жамбылской области Респуб- лики Казахстан).
Исследуемый материал от КРС с клиничес- кими признаками нодулярного дерматита (кожа и сыворотка крови переболевших животных) был получен в районной ветеринарной станции г. Аксу Павлодарской области. Для контроля специфичности метода использовали материал, полученный в районной ветеринарной стан- ции г. Аксу Павлодарской области от здоровых животных и животных с проявлением сходных клинических признаков поражения кожи, но без положительной реакции по вирусоскопии. Здесь же для прижизненной диагностики у больных
животных были взяты образцы сыворотки кро- ви на разных стадиях инфекционного процесса (начальный период, выраженные признаки забо- левания, выздоровление).
Всего исследовано 32 пробы сыворотки крови больных и здоровых животных с антигеном ви- руса оспы овец и 12 проб органотканевого мате- риала. Все реакции для статистической обработ- ки проводили в пяти вариантах.
В процессе исследования применяли методы вирусоскопии (окраска по методу А.М. Морозова, 1925); РСК в модификации длительного связы- вания комплемента; РДП по методу Оухтерлони, используя 1 % агар Difco, поддерживая реакцию при температуре (37±1) °C в течение двадцати четырех часов.
Для получения образцов сыворотки крови отбор производился в стерильные пробирки, которые помещали в термостат при темпера- туре (37±1) °С на три-четыре часа. После от- деления сыворотки ее разливали в отдельные стерильные пробирки, при необходимости цен- трифугировали для осаждения клеток крови и использовали в серологических реакциях для обнаружения антител.
Для исследования в серологических реакциях на обнаружение вирусного антигена нодулярного дерматита КРС использовали участки поражен- ной кожи, из проб которых была приготовлена 20 % суспензия в физиологическом растворе, которую однократно замораживали и оттаива- ли, центрифугировали при 4000–5000 об/мин в течение 30 мин и супернатант использовали для исследования.
Результат РСК считали положительным, если в двух пробирках с последовательными разведе- ниями испытуемого материала (сыворотки или органотканевого антигена) была полная (задерж- ка гемолиза 100 %) или выраженная задержка ге- молиза, по меньшей мере, на 2 креста в каждой пробирке (гемолиз 50 %) или более выраженная (25–0 % гемолиз). За титр испытуемого мате- риала в этом случае принимали последнее его разведение, вызывающее задержку гемолиза на 50 % и более.
Результат РДП в агаровом геле по методу Оухтерлони считался положительным, если между лунками с исследуемым материалом (ор- ганотканевой материал или сыворотка крови) и диагностическим препаратом образовались визуально заметные полосы преципитации. По- следнее разведение испытуемого материала, вызывающее проявление линии преципитации, принимали за его титр [9].
При исследовании сыворотки крови диагности- ческие антигены вируса оспы овец вводили в цен- тральные лунки в разведении 1 : 2, в перифериче- ских исследуемая сыворотка крови была интактной. При постановке реакции для проверки специ- фичности и активности диагностических препа- ратов делали постановку контрольных проб от
здоровых животных.
Серологические реакции РДСК, РДП были использованы для определения специфической активности сыворотки крови животных, а также для выявления и количественного определения специфических антигенов вируса нодулярного дерматита КРС в коже больных животных.
В количественной версии РДСК и РДП иссле- дуемый материал использовали в виде суспен- зии пораженных участков кожи в разведениях от 1 : 2 до 1 : 24, либо сыворотки в разведениях от цельного до 1 : 32, реакции проводили с соот- ветствующими специфическими и контрольными нормальными диагностическими препаратами,
взятыми в рабочем разведении, и комплементом с использованием его четырехкратного предель- ного титра в гемолитической системе.
В качественном варианте РДСК и РДП иссле- дуемый материал использовали в разведении 1 : 2. Статистическую обработку полученных дан- ных проводили разностным методом Стьюдента,
описанным В.А. Чистяковым [10].
Результаты исследования и их обсужде- ние. Как видно из данных, представленных в таблице 1, вирус-специфические антитела, свя- занные с антигеном вируса Sheeppox, были об- наружены в сыворотке крови больных животных в разные периоды заболевания. Так, у животных с выраженными клиническими признаками – в титрах до 1 : 8 в РДСК и в разведениях до 1 : 2 в РДП. У переболевших животных он составил в РДСК до 1 : 16 и РДП до 1 : 4.
Сыворотка крови от животных с другими забо- леваниями и сыворотка крови от здорового скота показали отрицательную реакцию.
Таблица 1
Результаты серологических реакций при исследовании проб сыворотки крови больного КРС с антигеном вируса оспы овец
|
Испытуемые сыворотки крови от животных |
Кол-во проб |
Антиген вируса оспы овец |
|
|
РДСК |
РДП |
||
|
С выраженными клиническими признаками |
12 |
1 : 2–1 : 8 |
Ц–1 : 2 |
|
Выздоровевших (реконвалесцентов) |
4 |
1 : 4–1 : 16 |
1 : 2–1 : 4 |
|
Больных дерматитом без положительной вирусоскопии |
10 |
– |
– |
|
Здоровых |
6 |
– |
– |
Из данных таблицы 2 видно, что при использо- вании специфической сыворотки для вируса оспы овец антигены нодулярного дерматита КРС были обнаружены в образцах кожи в титрах от целого до 1 : 8 в РДСК и в разведениях до 1 : 4 в РДП.
Исследования по контролю специфичности препаратов кожи КРС, полученных от здоровых и больных животных с другими кожными заболева- ниями, показали отрицательный результат.
Таблица 2
Результаты исследования в РДСК и РДП проб органотканевого материала у КРС
|
Органотканевой материал |
Кол-во проб |
Сыворотка к оспе овец |
|
|
РДСК |
РДП |
||
|
Подтвержденный вирусоскопией на наличие оспоподобного вируса |
4 |
1 : 4–1 : 8 |
1 : 2–1 : 4 |
|
С отрицательной вирусоскопией |
4 |
– |
– |
|
Контроль (материал от здоровых животных) |
4 |
– |
– |
В результате проведенных исследований было установлено, что серологические реакции на нодулярный дерматит у КРС могут быть вы- полнены с использованием средств и методов диагностики оспы овец.
Прямая диагностика
На основании проведенного исследования ниже предлагается схема прямой и ретроспек- тивной серологической диагностики нодулярного дерматита КРС (рис.).
Ретроспективная диагностика
Нодулярный дерматит
не подтвержден
Отрицательный результат
РДСК, РДП
с использованием
вируса оспы овец
|
Вирусоскопия по Морозову |
|
Положительный результат
РДСК, РДП
Положительный результат (диагноз на НД КРС
подтвержден)
Отрицательный результат (диагноз на НД КРС
не подтвержден)
с использованием диагностического антигена вируса оспы овец
Положительный результат
Отрицательный результат
Диагноз подтвержден
Диагноз
не подтвержден
Противоэпизоотические мероприятия
Схема прямой и ретроспективной серологической диагностики нодулярного дерматита КРС
Для прямой диагностики (обнаружения вирус- ного антигена) в качестве проб патологического материала необходимо использовать кусочки по- раженной кожи КРС.
На первом этапе готовят мазок-отпечаток из пораженной кожи на участке, граничащем со здо- ровой кожей. Мазок окрашивают по методу сере- брения по А.М. Морозову.
При отрицательном результате вирусоскопии по А.М. Морозову проводят дальнейшую диагно- стику на наличие других заразных или незараз- ных заболеваний, вызывающих дерматиты.
При положительном результате вирусоскопии из участков пораженной кожи готовят суспензию на физиологическом растворе, которую иссле- дуют методами РДСК и РДП с использованием специфических диагностических сывороток при оспе овец. При положительном результате диа- гноз на нодулярный дерматит КРС считают уста- новленным.
Для ретроспективной диагностики нодуляр- ного дерматита КРС отбирают сыворотки крови от больных и переболевших животных, которые исследуют методами РДСК и РДП с использо- ванием диагностических антигенов, взятых из наборов для диагностики при оспе овец. Положи- тельный результат серологических реакций сви- детельствует о болезни или переболевании КРС нодулярным дерматитом.
Этот метод в настоящее время рекомендует- ся для индикативной и дифференциальной диа- гностики нодулярного дерматита КРС. С этой це- лью предлагается к практическому применению для КРС использование разработанной схемы прямой и ретроспективной серологической диа- гностики заболевания.
Выводы. Нодулярный дерматит является от- носительно новым и не типичным для Казахста- на инфекционным заболеванием КРС.
В реакциях диффузионного осаждения и свя- зывания комплемента с использованием диа- гностических наборов для оспы овец была под- тверждена антигенная связь между нодулярным вирусом КРС и вирусом оспы овец.
Средства и методы лабораторной диагно- стики оспы овец могут быть использованы для прижизненной и посмертной диагностики ноду- лярного дерматита КРС с высокой степенью эф- фективности и надежности.
1. Республика Казахстан. О государственном регулировании развития агропромышленно- го комплекса и сельских территорий: закон от 8 июля 2005 г. № 66-III ЗРК // Казахстанская правда. 2005. 12 июля.
2. Şevik M. Epidemiological and Molecular Studies on Lumpy Skin Disease Outbreaks in Turkey during 2014–2015 // Transbound Emerg Dis. 2016. Vol. 64, № 4. Р. 6.
3. Saegerman C. Risk of introduction of Lumpy Skin Disease into France through imports of cattle // Transbound Emerg Dis. 2019. Vol. 66, № 2. Р. 40.
4. Мищенко А.В., Мищенко В.А. Эпизоотиче- ская ситуация по трансграничным и эконо- мически значимым инфекционным болезням КРС в России в 2013–2014 гг. // Х Балтий- ский форум ветеринарной медицины и про- довольственной безопасности: тез. конф (Санкт-Петербург, 18–20 сентября 2014 г.). СПб., 2014. С. 165–167.
5. Обеспечение ветеринарной безопасности в хозяйствах – членах республиканской Палаты казахской белоголовой породы / сост. А.А. Суминов, А.Ю. Мальчевский. Астана, 2015. 54 с.
6. Косарева О.А., Кукушкина М.С., Константи- нов А.В. и др. Нодулярный дерматит (бугор- чатка), клинические признаки при эксперимен- тальном заражении крупного рогатого скота // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. Владимир, 2010. Т. 8. С. 73–83.
7. Орлова Е.С. Совершенствование методов диагностики оспы овец и оспы коз: автореф. … дис. канд. биол. наук. Владимир, 2007. 23 с.
8. Кулык И.И., Никитин Е.Б. Гетерологичная серологическая диагностика нодулярного дерматита крупного рогатого скота // Мат-лы V Междунар. науч.-практ. конф. Павлодар, 2020. С. 246–249.
9. Сюрин В.Н. Руководство по ветеринарной ви-русологи. М.: Колос, 1966. С. 55–76.
10. Ивченко Г.И., Медведев Ю.И., Чистяков А.В. Задачи с решениями по математической ста- тистике. М.: Дрофа, 2007. 318 с.
