Yakutsk, Russian Federation
The purpose of research is to study the effect of freezing conditions on the proteolytic activity of sym-biotic starter. Freezing was carried out in a refrigerator LGPv 8420, Liebherr. Solutions of glycerol, gelatin, and sucrose were used as cryoprotectants, with which the concentrated bacterial mass was suspended. As a result of the research of thermal analysis data, a thermogram of the process of freezing a symbiotic starter was obtained. A cryoscopic temperature of minus 2.8 °C, an optimal freezing temperature of minus 25 °C, and a process duration of 90 minutes were established. Further studies were carried out on the proteolytic activity of thawed samples on milk agar. The study of the effect of various cryoprotectants on the preservation of the proteolytic activity of the bacterial concentrate indicates that the use of glycerol as a protective medium has a positive effect on its functional properties. The proteolytic activity of the microflora affects the formation of the amino acid composition of the product. The paper analyzes the amino acid composition of the product obtained by fermenting milk with a thawed bacterial concentrate. For control, kurunga was used on liquid kurunga sourdough on skimmed milk. Amino acid analysis of the samples was carried out by ion chromatography with post-column derivatization of amino acids with ninhydrin in the acid hydrolyzate of the sample on an INGOSAAA-400 amino acid analyzer. The level of balance of the amino acid composition of milk fermented with thawed bacterial concentrate with glycerin was determined. The data obtained made it possible to establish that freezing at minus 25 °C for 90 minutes with glycerin allows maintaining the high proteolytic activity of the microbial consortium and obtaining a dairy product with a complete protein composition.
kurunga, amino acids, autoselection, bioavailability, lactics, bacterial concentrate, amino acid score, mixed fermented dairy products, microbial consortium, natural starter
Введение. Основным этапом в производстве бактериальных заквасок является консервирование. Замораживание является распространенным способом длительного сохранения жизнеспособности микробиологических препаратов. Воздействие низких температур может привести к повреждению плазматической мембраны, клеточной оболочки, денатурации белков, изменению ДНК микроорганизмов из-за внутри- и внеклеточного образования льда. Это ведет к денатурации белков и нарушению барьеров проницаемости [1]. На устойчивость микроорганизмов к замораживанию влияют условия и стадия развития, температура и скорость замораживания, среда замораживания. Повышают выживаемость клеток внесением различных защитных сред для замедления процессов внутриклеточного льдообразования [2–6].
Для сохранения высокой жизнеспособности микроорганизмов используют различные питательные среды: желатин, глицерин, обезжиренное молоко, пептон, сахарозу, сорбит, поливинилпирролидон, глутамат натрия и их комбинации [7].
Цель исследования – изучение протеолитической активности замороженного бактериального концентрата (ЗБК) курунговой закваски.
Задачи: определение температуры и продолжительности замораживания бактериального концентрата; изучение влияниz криопротекторов на протеолитическую активность размороженного бактериального концентрата; анализ аминокислотного состава курунги, полученной сквашиванием молока размороженным бактериальным концентратом.
Материалы и методы. Для исследования использовали общепринятые, стандартные и оригинальные методы биохимического, физико-химического и микробиологического анализа.
Для оценки протеолитической активности бактериального концентрата 1 мл исследуемого продукта вносили пипеткой в чашки Петри и заливали 10–15 мл расплавленного и охлажденного до 40–45 °С молочного агара. Посевной материал тщательно перемешивали с молочным агаром. Пробы термостатировали при температуре 30 °С в течение 48 ч. Гидролиз казеина обнаруживали по зоне просветления среды вокруг колонии [8].
Аминокислотный анализ образцов проводился методом ионной хроматографии с постколоночной дериватизацией аминокислот нингидрином в кислотном гидролизате образца на аминокислотном анализаторе INGOSААА-400.
Оценку биологической ценности проводили по методике И.А. Рогова и Н.Н. Липатова по коэффициентам различий аминокислотного скора (КРАС) и биологической ценности (БЦ).
Результаты и их обсуждение. На этапе замораживания формируются кристаллы льда и определяется микроструктура бактериального концентрата. При разработке технологии замороженного бактериального концентрата необходимо определить криоскопическую температуру – температуру начала кристаллизации содержащейся в ней влаги. Динамика изменения температуры при замораживании бактериального концентрата представлена на таблице 1.
Таблица 1
Динамика температуры при замораживании бактериального концентрата
|
Показатель |
Значение |
||||||||||||
|
Продолжительность замораживания, мин |
0 |
10 |
20 |
30 |
40 |
50 |
60 |
70 |
80 |
90 |
100 |
110 |
120 |
|
Температура, °С |
10 |
–2,8 |
–1,3 |
–1,5 |
–2,6 |
–9,5 |
–20 |
–23 |
–24 |
–25 |
–25 |
–25 |
–25 |
Из данных таблицы 1 видно, что полученный температурный профиль замораживания бактериального концентрата можно разделить на три участка. В течение 10 мин наблюдается резкое снижение температуры с постоянной скоростью до 2,8 °С. Затем наблюдается повышение температуры и равновесное состояние в течение 30 мин. В течение этого времени происходит кристаллизация влаги, снижение температуры замедляется. Известно, что при зарождении кристаллов происходит выделение скрытой теплоты [9]. Потом температура умеренно уменьшается и через 90 мин наступает полное замораживание льда при температуре минус 25 °С.
При замораживании необходимо обеспечить защиту микроорганизмов от криоповреждений. В качестве криопротекторов использовали глицерин, сахарозу, желатин, широко применяемые для консервирования микроорганизмов и обеспечивающие их высокую выживаемость.
В таблице 2 представлены данные сравнительного анализа протеолитических свойств исследуемых образцов. В качестве контроля использовали исходный инокулят – жидкую курунговую симбиотическую закваску на обезжиренном молоке.
Таблица 2
Влияние криопротекторов на протеолитическую активность
бактериального концентрата при замораживании
|
Образец |
Диаметр зоны просветления вокруг колоний через 48 ч культивирования, мм |
|
Контроль – исходный инокулят |
32+5 |
|
Бактериальный концентрат + желатин |
20+5 |
|
Бактериальный концентрат + глицерин |
45+5 |
|
Бактериальный концентрат + сахароза |
3+2 |
Из представленных в таблице 2 данных следует, что бактериальный концентрат, замороженный с глицерином, проявляет большую протеолитическую активность. Вероятно, это связано с высокой концентрацией микроорганизмов в бактериальном концентрате и смешанным эндо-экстрацеллюлярным действием глицерина на клетки при замораживании.
От протеолитической активности заквасочных культур зависит аминокислотный состав готового продукта [10, 11]. В таблице 3 представлены результаты оценки аминокислотного состава молока, заквашенного бактериальным концентратом с глицерином. Для сравнения использовали образец, заквашенный исходной жидкой курунговой закваской на обезжиренном молоке.
Сквашивание молока проводили в течение 8–10 ч до достижения титруемой кислотности в образцах курунги 120 °Т. Результаты исследования аминокислотного состава образцов представлены в таблице 3.
Таблица 3
Содержание незаменимых аминокислот
|
Аминокислота |
Количество, мг/100 г продукта |
|
|
Курунга на жидкой закваске |
Курунга на ЗБК |
|
|
Валин |
126 |
129 |
|
Лейцин |
218 |
227 |
|
Изолейцин |
148 |
140 |
|
Фенилаланин + тирозин |
179 |
168 |
|
Метионин + цистин |
87 |
84 |
|
Лизин |
218 |
216 |
|
Триптофан |
22 |
22 |
|
Треонин |
112 |
115 |
|
Общее количество незаменимых аминокислот |
1110 |
1101 |
Из данных таблицы 3 видно, что количественное соотношение незаменимых аминокислот в курунге, заквашенной ЗБК и жидкой курунговой закваской, практически не отличается.
Результаты расчета аминокислотного скора исследуемых образцов представлены в таблице 4.
Таблица 4
Аминокислотный скор белков кисломолочных продуктов
|
Аминокислота |
Рекомендуемое кол-во по ФАО/ВОЗ, мг/г белка |
Значение аминокислотного скора, % |
|
|
Курунга на жидкой закваске |
Курунга на ЗБК |
||
|
Валин |
39 |
115 |
117 |
|
Лейцин |
59 |
132 |
137 |
|
Изолейцин |
30 |
176 |
166 |
|
Фенилаланин + тирозин |
38 |
168 |
157 |
|
Метионин + цистин |
22 |
140 |
136 |
|
Лизин |
45 |
173 |
171 |
|
Триптофан |
6 |
133 |
133 |
|
Треонин |
23 |
173 |
178 |
Из таблицы 4 видно, что белки исследуемых кисломолочных продуктов характеризуются полноценным аминокислотным составом. По всем незаменимым аминокислотам во всех образцах наблюдается избыток относительно физиологических потребностей организма человека.
Коэффициент различия аминокислотного скора (КРАС) и биологическая ценность белка (БЦ) указывают предельно возможный уровень использования азота белка на пластические цели (табл. 5).
Таблица 5
Показатели сбалансированности аминокислотного состава
кисломолочных продуктов, %
|
Показатель |
Курунга на жидкой закваске |
Курунга на БКМК |
|
КРАС |
36,5 |
35,37 |
|
БЦ |
63,5 |
64,6 |
Из таблицы 5 видно, что сбалансированность состава незаменимых аминокислот в обоих образцах курунги имеет почти одинаковые значения. Полученные данные свидетельствуют о соответствии биохимической активности бактериального концентрата микробного консорциума естественной курунговой закваске и возможности получения продукта с биологически ценным
составом белка, характерным для традиционного напитка.
Заключение. В результате проведенного исследования установлено, что замораживание бактериального концентрата в течение 90 мин до температуры минус 25 °С с глицерином позволяет сохранить высокую протеолитическую активность закваски и производить курунгу с высокой биологической активностью.
1. Matematicheskoe modelirovanie etapa zamorazhivaniya v tehnologii liofilizirovannyh lekarstvennyh form / E.V. Blynskaya [i dr.] // Rossiyskiy bioterapevticheskiy zhurnal. 2018. T. 17, № 2. S. 15–21.
2. Zandanova T.N. Vybor krioprotektorov dlya zamorazhivaniya bakterial'nogo koncentrata simbioticheskoy zakvaski // Vestnik KrasGAU. 2021. № 3 (168). S. 163–168.
3. Korotkaya E.V. Vliyanie zamorazhivaniya na aktivnost' nekotoryh vidov molochnokislyh bakteriy // Innovacii v biotehnologii: sb. tr. Mezhdunar. simpoziuma / pod obsch. red. A.Yu. Prosekova. Kemerovo: Kemerov. gos. un-t, 2018. S. 188–192.
4. Biophysical characterization of the Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus membrane during cold and osmotic stress and its relevance for cryopreservation / J. Meneghel [et al.] // Applied Microbiology and Biotechno¬logy. 2017. Vol. 101. Issue 4. P. 1427–1441. DOI:https://doi.org/10.1007/s00253-016-7935-4.
5. Buaynov O.N., Buaynova I.V. The physical and chemical changes of water and the hydration of the protein complex in cheese during freezing // Foods and Raw Materials. 2016. Vol. 4, № 1. P. 13–18. DOI:https://doi.org/10.21179/2308-4057-2016-1-13-18.
6. Fonseca F., Béal C., Corrieu G. Operating conditions that affect the resistance of lactic acid bacteria to freezing and frozen storage // Cryobiology. 2001. Vol. 43 (3). P. 189–198. DOI:https://doi.org/10.1006/cryo.2001.2343.
7. Frolova M.D. Osobennosti razrabotki liofilizirovannyh zakvasok // Molochnaya promyshlennost'. 2008. № 6. S. 70–71.
8. Bannikova L.A. Mikrobiologicheskie osnovy molochnogo proizvodstva. Moskva: Ripol Klassik, 1987.
9. Kandil S., Soda E. Influence of freezing and freeze drying on intracellular enzymatic activity and autolytic properties of some lactic acid bacterial strains // Advances in Microbiology. 2015. № 5. P. 371–382. DOI:https://doi.org/10.4236/aim. 2015.56039.
10. Peptidases and amino acid catabolism in lactic acid bacteria / J.E. Christensen [et al.] // Anto-nie Van Leeuwenhoek. 1999. Vol. 76. P. 217–246.
11. The proteolytic systems of lactic acid bacteria / E.R.S. Kunji [et al.] // Antonie Van Leeuwenhoek. 1996. Vol. 70. P. 187–221.
