To conserve rare and endangered plant species, along with the classical methods of ex situ conservation, it is necessary to create in vitro genetic banks. When forming a collection of in vitro plants, one of the important stages of clonal micropropagation is obtaining sterile explants at the injection stage. Seeds were used as explants for rare and endangered plant species. The plant material for the in vitro collection was obtained from the seed bank of the Sirius Children's Botanical Garden. The purpose of research is to create an in vitro genetic bank of rare and endangered plant species on the basis of the Sirius Educational Center. When using this sterilization protocol, the maximum yield of sterile explants was obtained for different plant species, and for some species, seed germination was noted at an early date. For seed germination, a hormone-free medium was chosen according to the prescription of Murashige and Skoog (MS). As a result of the analysis of the obtained data, we have determined an effective protocol for sterilization of seeds in vitro for 14 rare and endangered plant species. At the early stages of the growth and development of explants, seed germination was observed in six species (Maikaragan Volga, Cretaceous resin, Gelman's resin, Fragrant Levkoy, Dioscorea Nippon and Chalk jaundice) plants with a total share of 20–100 %, on the basis of which it is possible to develop methods of clonal micropropagation and preservation of the studied plant species.
rare and endangered plant species, sterilization, introduction, germination, in vitro bank.
Введение. Разработка методов клонального микроразмножения является основой для создания генетических банков in vitro редких и исчезающих видов растений, а также одним из перспективных направлений сохранения биоразнообразия в целом [1–3].
При создании генетических банков особое внимание уделяется репрезентативности и сохранению генетической устойчивости видов растений. Одним из наиболее привлекательных преимуществ сохранения in vitro является возможность получения стерильных культур видов (редких, эндемичных) без удаления их из естественной среды обитания, что способствует предотвращению уничтожения фитоценозов [4, 5].
Методы биотехнологии позволяют из незначительного количества исходного материала в кратчайшие сроки получить большое число выровненного посадочного материала. Адаптированные растения можно использовать для пополнения коллекционных фондов, изучения биохимического состава, проведения генетического мониторинга, а также для реинтродукции и усиления ослабленных природных популяций редких видов [6].
Наиболее представительными в России по разнообразию генетического банка in vitro редких и исчезающих видов растений в последние годы считаются ГБС РАН (г. Москва) и ГБУ ВО «ВРБС» (г. Волгоград) [7, 8].
При формировании коллекции in vitro растений одним из важных этапов клонального микроразмножения является получение стерильных эксплантов на этапе введения. При стерилизации семян и вегетативных частей редких и исчезающих видов растений часто используют в качестве основного стерилизатора 7%-й раствор гипохлорита кальция или натрия с экспозицией 1–25 мин. В качестве детергента применяют TWEEN-20 [9]. В ходе экспериментальных исследований установлено, что оптимальным режимом стерилизации семян редких видов может выступать 5%-й лизоформин с экспозицией 7 минут [10].
Цель исследования. Создание генетического банка in vitro редких и исчезающих видов растений на базе Образовательного центра «Сириус».
Объекты и методы исследования. Растительный материал для формирования коллекции in vitro был получен из семенного банка Детского ботанического сада «Сириус». Исследования по введению семенного материала редких и исчезающих видов растений в культуре in vitro проводили в лаборатории клеточной биологии на базе Образовательного центра «Сириус» в 2021 г. в соответствии с методическими рекомендациями [11, 12]. Объектами исследований являлись 13 редких и исчезающих видов растений, занесенных в Красную книгу Российской Федерации: Calophaca wolgarica (L. fil.) Fisch. ex DC. (майкараган волжский), Hedysarum grandiflorum Pall. (копеечник крупноцветковый), Zingeria Biebersteiniana (Claus) P.A. Smirn. (цингерия Биберштейна), Artemisia salsoloides Willd. (полынь солянковидная), Silene Hellmanii Claus (смолевка Гельмана), Silene cretacea Fisch ex. Spreng (смолевка меловая), Dioscorea nipponica Makino (диоскорея ниппонская), Erysimum cretaceum (Rupr) schmalh (желтушник меловой), Matthiola fragrans (Fisch) Bunge (левкой душистый), Panax ginseng C.A. Mey. (женьшень обыкновенный), Crambe steveniana Rupr. (катран Стевена), Jurinea cretacea Bunge (наголоватка меловая), Bellevalia speciosa Woronow ex Gross (бельвалия сарматская), Asphodeline taurica (Pall. ex Bieb.) Kunth (асфоделина крымская), 2 вида занесены в региональные Красные книги – Erysimum cretaceum (Rupr) schmalh (желтушник меловой), Sedum subulatum (C.A. Mey.) Boiss. (очиток шиловидный).
В качестве эксплантов редких и исчезающих видов растений использовали семена. Стерилизацию растительного материала проводили в несколько этапов. Для первичной поверхностной стерилизации семена замачивали в мыльном растворе на 15 минут. Затем растительный материал тщательно промывали проточной водой в течение 60 минут. 20%-й раствор средства «Доместос» с активным веществом в его составе гипохлорита натрия NaOCl и 70% С2H5OH использовали для дальнейшей очистки эксплантов от инфекции. Перед введением в культуру in vitro семена промывали дистиллированной водой. Для прорастания семена высаживали на безгормональную агаризованную питательную среду Мурасиге-Скуга (МС). В качестве минеральной основы питания использовали готовые компоненты «Биолот» среды МС. Уровень pH питательной среды нормализовали с помощью 1 М NaОН раствора до уровня 5,7 перед автоклавированием. Автоклавирование проводили в течение 20 минут при 120 °C и 2,0 атмосфер в стерилизаторе Tuttnauer-2340 (Израиль). Работы по изолированию эксплантов осуществляли в асептических условиях – ламинарных боксах Neoteric (Россия).
Результаты исследования и их обсуждение. На этапе введения семенного материала редких и исчезающих видов растений в культуру in vitro важной особенностью является получение стерильной культуры с целью последующей разработки технологии клонального микроразмножения и создания генетического банка in vitro.
При использовании данного протокола стерилизации был получен максимальный выход стерильных эксплантов для разных видов растений, а также для некоторых видов отмечалась всхожесть семян в ранние сроки (рис. 1).
Рис. 1. Эффективность стерилизации первичных эксплантов
и всхожесть редких и исчезающих видов растений
Анализируя полученные данные, выявлено, что через 5–7 дней после помещения семян на питательную среду отмечали всхожесть у шести видов растений: майкараган волжский, смолевка меловая, смолевка Гельмана, левкой душистый, диоскорея ниппонская и желтушник меловой. Всхожесть семян изученных генотипов варьировала в пределах 20–60 %. Максимальный процент прорастания семян наблюдался у смолевки меловой и майкарагана волжского –
60–100 % соответственно, прорастание первых семян майкарагана зафиксировано уже на второй день после введения в культуру (рис. 2).
|
|
|
|
Майкараган волжский |
Смолевка меловая |
Рис. 2. Начальный этап роста и развития растений из семенного материала
на этапе введения в культуру in vitro
Успешное применение высокоэффективного протокола стерилизации семян в настоящем исследовании предлагает важнейшую стратегию для дальнейшего размножения и сохранения редких и исчезающих видов растений, а также создания генетического банка in vitro.
Выводы. Для сохранения редких и исчезающих видов растений наряду с классическими методами сохранения ex situ необходимо создание генетических банков in vitro.
В результате проведенного эксперимента был подобран оптимальный режим стерилизации, при котором большинство видов растений оказались стерильными, за исключением цингерии Биберштейна. На ранних этапах роста и развития эксплантов наблюдалось прорастание семян у шести видов растений с общей долей – 20–100 %.
1. Zholobova O.O., Korotkov O.I., Safronova G.N. i dr. Sohranenie redkih i ischezayuschih vidov rasteniy pri pomoschi metodov biotehnologii // Sovremennye problemy nauki i obrazovaniya. 2012. № 1. S. 19.
2. Novikova T.I. Ispol'zovanie biotehnologicheskih podhodov dlya sohraneniya bioraznoobraziya rasteniy // Rastitel'nyy mir Aziatskoy Rossii. 2013. 2 (12). S. 119–128.
3. Knyazeva I.V., Sorokopudov V.N., Sorokopudova O.A. Kompleksnaya ocenka vliyaniya pitatel'noy sredy i temperatury na sohranenie zemlyaniki sadovoy in vitro // Vestnik KrasGAU. 2020. № 7. S. 47–55.
4. Leung D.W.M. Plant biotechnology helps quest for sustainability: With an emphasis on climate change and endangered plants. In Climate Change and Sustainable Development; Reck R., Ed.; Linton Atlantic Books: Louisville, KY, USA, 2010. pp. 247–250.
5. Chokheli V.A., Dmitriev P.A., Rajput V.D., Bakulin S.D., Azarov A.S., Varduni T.V, Stepanenko V.V., Tarigholizadeh S., Rupesh K.S., Krishan K.V., Minkina T.M. Recent Development in Micropropagation Techniques for Rare Plant Species // Plants 2020. 9. 1733; DOI:https://doi.org/10.3390/plants9121733
6. Molkanova O.I., Egorova D.A., Mitrofanova I.V. Preservation characteristics of valuable plant species in in vitro genebanks at russian botanical gardens. In Vitro Cell. // Dev. Biol. 2018. 54. pp. 546–547 DOI:https://doi.org/10.1007/s11627-018-9929-7.
7. Malaeva E.V. Sohranenie redkih vidov rasteniy v geneticheskom banke Volgogradskogo regional'nogo botanicheskogo sada // Subtropicheskoe i dekorativnoe sadovodstvo. 2020. № 73. S. 61–68. DOI: 10.31360/ 2225-3068-2020-73-61-68.
8. Molkanova O.I., Gorbunov Yu.N., Shirni-na I.V. i dr. Primenenie biotehnologicheskih metodov dlya sohraneniya genofonda redkih vidov rasteniy // Botanicheskiy zhurnal. 2020, T. 105. № 6. S. 610–619.
9. Molkanova O.I., Konovalova L.I., Staheeva T.S. Osobennosti razmnozheniya i sohraneniya kollekcii cennyh i redkih vidov rasteniy v usloviyah in vitro // Byulleten' gosudarstvennogo Nikitskogo botanicheskogo sada. 2016. № 120. S. 17–23.
10. Malaeva E.V., Zholobova O.O., Korotkov O.I. Formirovanie i izuchenie kollekcii redkih vidov in vitro v Volgogradskom regional'nom botanicheskom sadu // Vedenie regional'nyh krasnyh knig: dostizheniya, problemy i perspektivy. Volgograd, 2015. S. 290–294.
11. Malaeva E.V., Korotkov O.I., Safronova G.N. i dr. Klonal'noe mikrorazmnozhenie redkih i cennyh vidov rasteniy: metod. rekomendacii. Volgograd, 2013. 44 s.
12. Metodologiya biotehnologicheskih issledovaniy cvetochno-dekorativnyh kul'tur / pod obsch. red. I.V. Mitrofanova. Volgograd, 2018. 268 s.
