Введение. Среди инфекционных заболева- ний бруцеллез представляет наибольшую опас- ность для здоровья человека. Болезнь, как пра- вило, протекает в хронической форме, вызывает поражение суставов и раннюю потерю трудоспо- собности.
К бруцеллезу восприимчивы все виды сель- скохозяйственных и многие виды диких живот- ных. В Кыргызстане бруцеллез среди яков диа- гностирован в 1955 г. на территории внутреннего Тянь-Шаня Нарынской и Иссык-Кульской обла- стей. Позже возбудитель бруцеллеза у яков был выявлен в южных регионах страны. Заражен- ность яков бруцеллезом в различных регионах не одинакова и колеблется от 1 до 60 %.
Как показывают наблюдения, наиболее опас- ным источником распространения бруцеллеза являются вагинальные и маточные выделения больных бруцеллезом якоматок. Они при родах инфицируют значительные участки пастбищ, являясь вторичным фактором передачи возбу- дителя бруцеллеза через травостой здоровым животным [1, 2].
Возбудитель бруцеллеза сельскохозяйствен- ных животных относится к роду Brucella, кото- рый в свою очередь подразделяется на 6 видов:
Br. abortus, Br. melitensis, Br. suis, Br. canis, Br. ovis, Br. neotomae. К возбудителям Br. abortus, Br. melitensis и Br. suis восприимчивы все виды домашних и сельскохозяйственных животных. Следовательно, эти 2 вида представляют наи- большую опасность [4, 5]. Для человека опас- ность представляет Br. melitensis (овечий вид). При этом, как установлено исследователями, Br. melitensis может мигрировать от заражен- ных овец и коз к крупному рогатому скоту [6]. В яководческих хозяйствах Таджикистана были установлены факты межвидовой миграции бру- целл от крупного рогатого скота к якам, а также регистрировались случаи выделения культуры Br. melitensis [3]. Так, С.Б. Чегировым установ- лены факты миграции возбудителя Br. melitensis от мелкого рогатого скота к крупному рогатому скоту, при этом были определены биовары 1-2-3 возбудителя [7, 8]. В последние годы в яковод- ческих хозяйствах Кыргызстана регистрируются частые случаи заражения бруцеллезом вида Br. abortus. При этом бруцеллез, вызванный видом Br. melitensis, среди яков не установлен.
Основную роль в противоэпизоотических ме- роприятиях по борьбе с бруцеллезом играет своевременное выявление фактов и путей меж-
видовой миграции возбудителя и определение видовой принадлежности возбудителя совре- менными методами.
Цель исследования: изучение наличия меж- видовой миграции возбудителя бруцеллеза сре- ди яков и видовой принадлежности бруцелл с помощью полимеразной цепной реакции.
Материалы и методы исследования. Ис- следование проводилось в Кыргызском научно- исследовательском институте ветеринарии, а также в Центре ветеринарной диагностики и экс- пертизы по северному региону. Исследования проведены с применением серологических мето- дик – роз-бенгал теста (РБТ), иммуноферментно- го анализа (ИФА) COMPELIS Akit for the diagnosis of Brucellosis фирмы «APHASCIENTIFIC» и клас- сического метода ПЦР. Постановку ПЦР анализа проводили согласно наставлению по диагности- ке бруцеллеза животных МСХ РФ от 29.09.2003 г.
№ 13-15-02/0850, а также с использованием ГОСТ КР 25385-91 «Животные сельскохозяйственные: методы диагностики бруцеллеза». В опыте было отобрано 56 яков разного пола, возраста из не- скольких яководческих хозяйств Иссык-Кульской, Нарынской областей. От них были взяты образ- цы крови и исследованы лабораторно на нали- чие бруцеллезной инфекции.
Из 56 проб, исследованных серологическими методами, 14 проб сывороток крови яков реаги- ровали положительно. Для выделения бруцелл были применены бактериологические методы исследований [4]. Для этого использовали пита-
тельные среды по культивированию на них бак- терий. Положительные пробы крови засевали на кровяной агар (по 5 мл), с добавленным антикоа- гулянтом в объеме 7 мл. Посевы выдерживали в термостате при температуре 36–37,5 °С. Инкуби- ровали в присутствии 10–15 % СО2 и в обычных атмосферных условиях. Рост культур обнаружи- вали в 8 пробах на 8-й день после засева. Биома- териалом для выделения возбудителя и поста- новки ПЦР использованы выраженные культуры. При постановке ПЦР для типизации бруцелл до вида экстрагировали нуклеиновую кислоту из выраженных культур бруцелл. В результате ко- пирования ПЦР продукта дифференцировали типовую принадлежность бруцелл.
Для типизации возбудителя бруцеллеза ис- пользовали метод ПЦР с применением набора QIAGEN «DNeasy®Blood&TissueKit». При поста- новке ПЦР анализа применяли реагенты и реак- ционные смеси фирмы Promega, а также прайме- рыфирмы«ОДОпраймтех»:универсальныйIS711 primer 5’–TGCCGATCACTTAAGGGCCTTCAT-3’,
Br. melitensis primer 5’-AAATCGCGTCCTTGCTGG TCTGA-3’, Br. abortus primer 5’-GACGAACGGAA TTTTTCCAATCCC-3’. Для учета результатов в амлификации применяли 2 % агарозный гель на 1x TAE буфере с бромистым этидием в системе BIO–RAD GelDoc XRTM.
Результаты исследования. Результаты ла- бораторных исследований на зараженность яков бруцеллезом с применением серологических ме- тодик РБТ и ИФА приведены в таблице.
Наличие положительно реагирующих проб на бруцеллез в реакциях РБТ и ИФА
|
№ п/п |
Возраст, лет |
Идентификационный номер |
РБТ |
ИФА |
ПЦР |
|||
|
проб |
% |
проб |
% |
проб |
% |
|||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
|
1 |
3 |
0397 |
– |
– |
||||
|
2 |
6 |
0373 |
– |
– |
||||
|
3 |
3 |
9960 |
+ |
+ |
||||
|
4 |
5 |
0295 |
– |
– |
||||
|
5 |
4 |
0350 |
+ |
+ |
||||
|
6 |
7 |
0447 |
+ |
+ |
+ |
|||
|
7 |
3 |
0291 |
– |
– |
||||
|
8 |
5 |
0329 |
– |
– |
||||
|
9 |
4 |
0303 |
+ |
+ |
||||
|
10 |
3 |
0293 |
+ |
+ |
||||
|
11 |
7 |
0306 |
– |
– |
||||
|
12 |
5 |
0346 |
– |
– |
||||
|
13 |
3 |
0290 |
– |
– |
||||
|
14 |
5 |
0365 |
+ |
+ |
+ |
|||
Окончание табл.
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
|
15 |
7 |
0297 |
– |
– |
||||
|
16 |
6 |
0304 |
+ |
+ |
+ |
|||
|
17 |
5 |
0324 |
– |
– |
||||
|
18 |
8 |
0435 |
+ |
+ |
+ |
|||
|
19 |
7 |
0319 |
+ |
+ |
+ |
|||
|
20 |
6 |
0448 |
+ |
+ |
+ |
|||
|
21 |
9 |
0334 |
– |
– |
||||
|
22 |
6 |
0282 |
– |
– |
||||
|
23 |
7 |
0368 |
– |
– |
||||
|
24 |
8 |
0388 |
– |
– |
||||
|
25 |
4 |
9962 |
– |
– |
||||
|
26 |
9 |
0364 |
– |
– |
||||
|
27 |
6 |
0385 |
– |
– |
||||
|
28 |
3 |
0337 |
– |
– |
||||
|
29 |
6 |
0433 |
+ |
+ |
+ |
|||
|
30 |
5 |
– |
+ |
+ |
+ |
|||
|
31 |
7 |
– |
– |
– |
||||
|
32 |
6 |
0285 |
– |
– |
||||
|
33 |
4 |
– |
– |
– |
||||
|
34 |
4 |
– |
– |
– |
||||
|
35 |
6 |
– |
– |
– |
||||
|
36 |
4 |
0331 |
– |
– |
||||
|
37 |
9 |
0325 |
– |
– |
||||
|
38 |
4 |
0413 |
– |
– |
||||
|
39 |
7 |
0323 |
+ |
+ |
||||
|
40 |
8 |
0398 |
+ |
+ |
||||
|
41 |
2 |
– |
– |
– |
||||
|
42 |
1 |
– |
– |
– |
||||
|
43 |
3 |
– |
– |
– |
||||
|
44 |
2 |
0281 |
– |
– |
||||
|
45 |
2 |
0333 |
– |
– |
||||
|
46 |
2 |
– |
– |
– |
||||
|
47 |
3 |
– |
– |
– |
||||
|
48 |
1 |
0430 |
– |
– |
||||
|
49 |
1 |
0432 |
– |
– |
||||
|
50 |
6 |
0353 |
– |
– |
||||
|
51 |
1 |
– |
– |
– |
||||
|
52 |
1 |
– |
– |
– |
||||
|
53 |
2 |
– |
– |
– |
||||
|
54 |
4 |
– |
– |
– |
||||
|
55 |
1 |
– |
– |
– |
||||
|
56 |
1 |
– |
– |
– |
||||
|
Всего 56 проб |
14 |
25 |
14 |
25 |
8 |
14 |
||
Как следует из данных таблицы, из 56 иссле- дованных образцов сыворотки крови положитель- но на бруцеллез реагировали 14 проб, т. е. 25 % от числа исследованных. А в реакции ПЦР из 14 положительных проб только в 8 пробах выявлены бруцеллы, т. е. 14 % от общего числа исследован- ных проб. В среднем зараженность яководческих
ферм, где проводились наблюдения, была в пре- делах 10–15 %. В связи с отсутствием профилак- тических мероприятий зараженность яков бруцел- лезом имеет тенденцию роста.
При типизации бруцелл ПЦР были обнаруже- ны специфические полосы на уровне 498 п.н. и одна проба на уровне 731 п.н. (рис.).
Результаты амплификации образцов
В 2 % агарозном геле обнаружены фрагмен- ты ДНК бактерии Br. abortus на уровне 498 п.н. и Br. melitensis на уровне 731 п.н.
В результате применения высокочувстви- тельного ПЦР анализа было установлено, что бруцеллез у 7 исследованных яков был вызван возбудителем Br. abortus и у одного Br. melitensis. Лабораторные исследования и проведенные на- блюдения показали, что миграция возбудителя Br. melitensis среди яков происходила в резуль- тате их контакта с инфицированным крупным и мелким рогатым скотом при совместном их со- держании на общих естественных пастбищах.
Выводы. Результаты наблюдений и лабо- раторных исследований показали, что распро- странение бруцеллеза среди яков происходит в большинстве случаев во время случек и отела якоматок. Межвидовая миграция возбудителя
бруцеллеза вида Br. melitensis среди яков, овец и крупного рогатого скота происходит в резуль- тате совместного их содержания на сезонных естественных пастбищах. Немаловажное место в распространении бруцеллеза занимает зара- жение пастбищного травостоя аборт плодами инфицированных якоматок.
Проведенные лабораторные исследования подтвердили вероятность миграции бруцелл ви- дов Br. abortus и Br. melitensis среди яков, о чем сообщалось другими исследователями. ПЦР диагностика по идентификации видов бруцелл является преобладающим методом установле- ния путей миграции возбудителя бруцеллеза и выбора средств и методов мер борьбы с бруцел- лезной инфекцией.
