Введение. Современное состояние молочного животноводства за последние десятилетия достигло значительного прогресса, однако увеличение надоев резко снизило срок использования животных в стаде, что оказало влияние на эффективность сельскохозяйственной отрасли в целом. Таким образом, наибольшую ценность в настоящее время приобретают высокопродуктивные коровы с продолжительным сроком хозяйственного использования [1, 2]. Начиная с конца прошедшего столетия ген LEP активно изучается и рассматривается как маркерный ген, обуславливающий относительно высокую продолжительность жизни и репродуктивность крупного рогатого скота [3].
Основной функцией пептидного гормона лептина, кодируемого геном LEP и вырабатываемого адипоцитами жировой ткани Bos taurus, является гормональная регуляция метаболизма липидов [4, 5]. Соответственно, наличие большого количества различных однонуклеотидных полиморфизмов гена LEP (~ 60 SNP, локализующихся как в экзонах гена, так и в его интронах и промоторах) обеспечивает еще большее количество вариаций аминокислотной последовательности гормона лептина, что сказывается на эффективности модуляции анаболизма и катаболизма, иммунного ответа, репродукции крупного рогатого скота [6, 7]. На данный момент наибольший интерес вызывают однонуклеотидные полиморфизмы следующих локусов гена LEP: A80V, Y7F и R25C. SNP локуса A80V (С→Т) расположен в позиции 95691973 п. н. (3-й экзон), SNP локуса R25C (T→C) – в позиции 95690050 п.н. (2-й экзон), SNP локуса Y7F (A→T) – в позиции 95689996 п. н. (2-й экзон).
Полиморфизм локуса A80V гена LEP с предпочтительным генотипом АА оказывает существенное влияние на продолжительность хозяйственного использования и уровень рентабельности животных. Исследование Н.В. Ковалюк с соавт. указывает на низкую частоту гомозиготных особей по аллелю V (9–13 %), но высокую частоту гетерозиготных (39–44 %) и гомозиготных особей по аллелю А [7].
Цель исследования – установление аллельного полиморфизма локуса A80V гена лептина (LEP) у коров-долгожителей холмогорской породы в племенном заводе Архангельской области (АО «Холмогорский племзавод»).
Задачи: определить частоты встречаемости аллелей и генотипов локуса A80V гена LEP у коров холмогорской породы, а также выявить связь полиморфизма локуса с продолжительностью хозяйственного использования.
Объекты и методы. Исмследование было выполнено в период с 2023 по 2024 г. в лаборатории инновационных технологий в АПК на базе ФГБУН ФИЦКИА УРО РАН.
Объектом исследования стали коровы холмогорской породы АО «Холмогорский племзавод». Общая численность поголовья в хозяйстве составляет около 1000 голов, в том числе 400 лактирующих коров. Из них была выделена группа коров, лактирующих по 4-й лактации и более, 81 голова.
Для проведения исследования был отобран биологический материал (кровь) из яремной вены в вакуумные пробирки с антикоагулянтом ЭДТА К3. Экстракция ДНК из цельной крови проводилась в соответствии с кратким руководством по применению набора реагентов для экстракции ДНК/РНК из биологического материала животных и продуктов питания животного происхождения «МагноПрайм ВЕТ» (ручная методика экстракции с использованием центрифугирования, ООО «НекстБио», Россия). Аллельные варианты локуса A80V гена LEP определяли методом ПЦР-ПДРФ.
Реакционная смесь для проведения амплификации на основе набора для проведения ПЦР с HS-Taq (+MgCl2) (ООО «Биолабмикс», Россия) характеризовалась следующим конечным составом: 10 мМ Трис-HCl (pH 8,5); 50 мМ KCl; 1,5 мМ MgCl2; 0,1 % (о/о) Tween 20; по 0,4 мкМ прямого (5’-CAAGCAGGAAATAGGGAGTCATGG-3’) и обратного (5’-CTGGTGAGGATCTGTTGGTAGGTC-3’) праймеров; по 0,2 мМ каждого dNTP; 2,5 е.а. HS-Taq DNA-полимеразы; 200 нг ДНК.
В таблице 1 представлен протокол температурных режимов циклов ПЦР.
Таблица 1
Процедура амплификации с горячим стартом
Hot-start amplification procedure
|
Стадия |
Температура, °C |
Время инкубации |
Количество циклов |
|
Предварительная денатурация |
95 |
3 мин |
1 |
|
Денатурация |
95 |
30 с |
32 |
|
Отжиг |
67 |
30 с |
|
|
Элонгация |
72 |
30 с |
|
|
Финальная элонгация |
72 |
7 мин |
1 |
Реакционная смесь для проведения рестрикции на основе набора эндонуклеазы рестрикции PspE I (ООО «СибЭнзайм», Россия) характеризовалась следующим конечным составом: 10 мМ Трис-HCl (pH 7,6); 10 мМ MgCl2; 1 мМ дитиотреитола; 10 е.а. эндонуклеазы рестрикции PspE I; 2000 нг ДНК. Смесь инкубировали при 37 °C в течение 19 ч. Для определения длин фрагментов ДНК, полученных в ходе рестрикций, было проведено электрофоретическое разделение в 2 % агарозном геле в течение 4 ч при 100 В.
Статистическую обработку результатов типирования проводили согласно Е.К. Меркурьевой и Г.Н. Шангину-Березовскому («Генетика с основами биометрии», 1983 г.).
Результаты и их обсуждение. По окончании статистической обработки результатов типирования поголовья установлены частоты встречаемости как самих аллелей A и V, так и формируемых ими гетеро- и гомозиготных генотипов, представленные в таблице 2. Так как рассчитанное значение критерия согласия Пирсона (0,016) намного меньше его стандартного значения (9,2 при числе степеней свободы 2 и уровне значимости альфа 0,01), то можно сделать вывод, что полученные значения частот встречаемости аллелей и генотипов соответствуют закону Харди – Вайнберга и не являются результатом направленной маркерной селекции, что подтверждается и фактически.
Таблица 2
Полиморфизм локуса A80V гена LEP у коров холмогорской породы
Polymorphism of the A80V locus of the LEP gene in cows of the Kholmogorsky breed
|
Показатель |
n |
Частота встречаемости генотипов |
Частота встречаемости аллелей, % |
χ² |
||||||
|
АА |
АV |
VV |
А |
V |
||||||
|
n |
% |
n |
% |
n |
% |
|||||
|
Наблюдаемое распределение |
81 |
65 |
80,25 |
15 |
18,52 |
1 |
1,23 |
90 |
10 |
0,016 |
|
Ожидаемое распределение |
65 |
80,11 |
15 |
18,79 |
1 |
1,10 |
||||
Определенную трудность вызывает сопоставление полученных данных с результатами научных исследований других пород крупного рогатого скота. Так, в исследованиях Л.В. Кононовой с соавт. [6, 8] зафиксированы следующие частоты встречаемости генотипов локуса A80V: AA – 35 %, AV – 5 % и VV – 60 % у красной степной породы (20 голов); у швицкой породы (16 голов) эти показатели составили соответственно 60 % для генотипа AA и 40 % для генотипа AV. Интересные результаты представлены в работе Н.В. Ковалюк с соавт. [9, 10], где абсолютное доминирующее положение в генофонде поголовья коров айширской породы (412 голов) занял генотип AA, чья частота встречаемости составила 100 %. Аналогичные результаты получены А.Е. Волченко с соавт. [11]: частота встречаемости генотипа AA составляет 95–98 %, частота встречаемости генотипа AV не превышает 5 %. Полное отсутствие генотипа VV также зафиксировано в исследованиях коров голштинской породы (40 голов) Е.В. Мачульской с соавт. [12].
В большинстве случаев сопоставление результатов будет некорректным, так как поголовья с точки зрения зоотехнии сформированы из различных групп коров (нетелей, первотелок, второтелок и полновозрастных коров); также поголовья с точки зрения генетики и эпигенетики сформированы из различных субпопуляций одной породы (территориально удалены друг от друга, принадлежат разным хозяйствам, животные находятся в разных условиях содержания); приводятся не все результаты статистической обработки данных (например, соответствие закону Харди – Вайнберга) и т. п.
Заключение
1. В генофонде коров-долгожителей холмогорской породы установлено доминирование аллеля А (90 %) и генотипа АА (80,25%) локуса A80V гена LEP. Аллель V (10 %), генотипы AV (18,52 %) и VV (1,23 %) встречались значительно реже.
2. Высокая частота встречаемости аллеля А локуса A80V гена LEP в генофонде коров-долгожителей холмогорской породы позволяет предположить, что именно этот аллель определяет генетическую предрасположенность этих животных к продолжительному хозяйственному использованию.
