Введение. Высшие базидиальные грибы содержат пищевые волокна, включая β-глюканы, хитин и гетерополисахариды (пектиновые вещества, гемицеллюлозы, полиурониды и др.) в количестве 10–50 % от сухой массы. Преимущество нерастворимых пищевых волокон заключается в сокращении времени прохождения пищи через кишечник, предотвращении нарушений регулярности его опорожнения и снижении риска развития колоректального рака [1, 2]. Польза для здоровья растворимых пищевых волокон, и особенно β-(1,3),(1,6)-D-глюканов, заключается в снижении уровня холестерина, концентрации глюкозы в плазме крови, факторов риска развития дегенеративных заболеваний, включая сердечно-сосудистые. Помимо этого, пищевые волокна грибов стимулируют рост полезной микрофлоры кишечника, благодаря чему используются в качестве пребиотиков [3]. Перспективным биологически активным веществом для исследований пищевых волокон, содержащихся в грибах, является хитин, из которого получают различные модифицированные формы, в частности хитозан и хитоолигосахариды [4].
Хитозан и хитоолигосахариды (ХОС) относятся к деацетилированным производным хитина. По сравнению с хитином хитозан и ХОС проявляют более высокую биологическую активность, что обусловливает их широкое применение в пищевой промышленности, медицине и сельском хозяйстве [5].
Хитоолигосахариды представляют собой олигомеры N-ацетил-D-глюкозамина (≥ 85 %) и D-глюкозамина (≤ 15 %), связанные β-1,4 гликозидными связями. Степень полимеризации (СП) ХОС, которая определяется степенью ферментативного гидролиза хитозана, составляет от 2 до 20, а их средняя молекулярная масса (ММ) – 3,9 кДа. ХОС обладают высокой пребиотической активностью – стимулируют рост лакто- и бифидобактерий. Эксперименты на мышах показывают, что ХОС со СП 2–8 обладают свойствами регуляции микрофлоры кишечника. Применение ХОС со СП 2–6 значительно увеличивает моторику кишечника, восстанавливает состав микробиоты кишечника и метаболический дисбаланс. Установлено, что ХОС могут применяться в качестве пребиотиков, поскольку стимулируют рост молочнокислых бактерий, одновременно подавляя кишечные патогены [3]. Согласно исследованиям [5] ХОС (СП 2-8, ММ < 1,5 кДа, СД 99,9 %) стимулируют рост Bifidobacterium и Lactobacillus в концентрациях от 0,1 до 0,5 %. Положительные результаты получены также при использовании ХОС (СП 4-9, ММ < 1,7 кДа, СД 60 %) стимулирующих рост L. paracasei и L. kefir в концентрации 0,1 %.
Кишечник человека населен примерно 100 триллионами микроорганизмов, включая 1000–1150 видов бактерий [6]. Эти виды взаимодействуют с организмом, регулируя баланс микробиоты кишечника, улучшая функции слизистой оболочки, иммунной системы хозяина, и существенно влияют на здоровье человека [7, 8].
В последние годы исследователи проявляют повышенный интерес к питанию, направленному на модуляцию кишечной микробиоты, в частности с применением хитоолигосахаридов. В совокупности оптимизация технологии получения ХОС и углубленное понимание их биологических функций позволят раскрыть их способность положительно влиять на состояние здоровья человека, что способствует достижению основных целей государственной политики, направленной на улучшение качества жизни населения. Таким образом, разработка способов получения хитоолигосахаридов (олигомеров β-1,4-связанного D-глюкозамина) с высокой пребиотической активностью из хитозана ракообразных и хитозан-глюкановых комплексов высших грибов с использованием доступного фермента целлюлазы является актуальной научно-прикладной задачей.
Цель исследования – разработка ферментативного способа получения хитоолигосахаридов, изучение их физико-химических и пребиотических свойств.
Задачи: разработать методику получения хитоолигосахаридов (ХОС) путем ферментативного гидролиза как коммерческого хитозана, так и хитозан-глюканового комплекса (ХтзГК), выделенного из плодовых тел грибов Ganoderma lucidum, с использованием доступного ферментного препарата «Целлолюкс-А»; исследовать физико-химические свойства полученных ХОС (характеристическая вязкость, молекулярная масса, степень деацетилирования) и определить их выход из различных исходных материалов; изучить пребиотическую активность полученных ХОС в отношении пробиотических штаммов микроорганизмов (Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium bifidum). Оценить эффективность ХОС, полученных из разных источников (хитозана и ХтзГК), в качестве стимуляторов роста пробиотических микроорганизмов; дать оценку целесообразности применения ферментного комплекса целлюлазы и ксиланазы вместо специфических ферментов (хитиназы и хитозаназы) для промышленного получения ХОС с выраженными пребиотическими свойствами.
Объекты и методы. В качестве объектов исследования использовались молочнокислые бактерии Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium bifidum, выделенные из коммерческих аптечных препаратов «Ацидофилин», «Лактожиналь», «Лактобактерии Рамнозус-СМ», «Био Лонг Лайф» и «Бифидумбактерин»; культивируемые высшие базидиальные грибы Ganoderma lucidum – источник для получения хитозан-глюканового комплекса и хитоолигосахаридов; коммерческий хитозан (изготовитель: Orison Chemicals Limited, Китай); ферментный препарат «Целлолюкс-А» (ООО ПО «Сиббиофарм», г. Бердск).
Для культивирования молочнокислых бактерий на агаризованных средах использовали селективные питательные среды для роста бактерий рода Lactobacillus, %: глюкоза – 2,0; пептон – 1,0; мясной экстракт – 1,0; дрожжевой экстракт – 0,4; CH3COONa · 3H2O – 0,5; полисорбат 80 – 0,1; KH2PO4 – 0,2; (NH4)3C6H5O7 – 0,2; % MgSO4 · 7H2O – 0,02; MnSO4 · 4H2O – 0,005; агар микробиологический – 1,0. pH доводили до 6,2 при 25 °C; для Bifidobacterium bifidum, %: панкреатический гидролизат казеина – 3,0; дрожжевой экстракт – 0,5; a-Д-лактоза – 0,25; Д-глюкоза – 0,75; цистеина гидрохлорид – 0,05; NaCl – 0,25; MgSO4 – 0,05; кислота аскорбиновая – 0,05; CH3COONa – 0,03; агар микробиологический – 0,09 (изготовитель – ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии», г. Оболенск).
Культивирование молочнокислых бактерий глубинным способом для определения пребиотической активности ХОС проводили в орбитальном термостатируемом шейкере-инкубаторе (Biosan Orbital Shaker-Incubator ES-20, Латвия) при температуре 37 °C в течение 48 ч. В состав питательной среды (без добавления агара) ХОС из хитин-глюканового комплекса (ХтзГК), ХОС из хитозана, ХтзГК и хитозана добавляли в количестве 0,5 %, ориентируясь на данные, представленные в источнике [9]. Количество посевного материала составляло 10 %. Отбор проб проводили через 6, 12, 24, 48 ч. Культивирование прекращали при значительном уменьшении сахаров питательной среды, пиковом показателе биомассы продуцентов и КОЕ. После ферментации в культуральной жидкости определяли КОЕ в 1 мл среды методом предельных разведений.
Для получения хитозан-глюкановых комплексов (ХтзГК) использовали хитин-глюкановый комплекс, выделенный из плодовых тел грибов Ganoderma lucidum. Получение ХтзГК проводили по следующей оригинальной методике: 1000 г измельченных плодовых тел (размер частиц 100–500 мкм) экстрагировали 70 %-м раствором этанола в течение 48 ч в статических условиях. Остаток в виде биошрота высушивали при температуре 40 °C. Высушенный биошрот вываривали с 1 Н NaOH при температуре 85 °C в течение 4 ч. Остаток промывали сначала водопроводной, затем дистиллированной водой для удаления остаточного количества NaOH. Затем к массе остатка добавляли при гидромодуле 1 : 3 3 % раствор H2O2 для депигментации. После чего повторно промывали дистиллированной водой. Остаток высушивали, измельчали и просеивали для получения размера частиц 10–50 мкм.
Дополнительную очистку хитозана и ХтзГК перед ферментативным гидролизом осуществляли следующим образом. Образцы хитозана (20 г) и ХтзГК растворяли в 1 л 1 %-го раствора уксусной кислоты. После фильтрации при пониженном давлении к фильтрату добавляли водный раствор 1 М NaOH для получения осадка. Осадок многократно промывали дистиллированной водой до достижения pH промывной воды около 7. Затем добавляли безводный изопропиловый спирт (200 мл) для удаления небольшого количества пигмента из хитозана и ХтзГК. После этого осадок высушивали в вакуумной печи. Очищенные хитозан и ХтзГК измельчали до порошкообразного состояния (10–50 мкм).
Ферментативный гидролиз хитозана и ХтзГК для получения хитоолигосахаридов осуществляли следующим образом. Раствор хитозана готовили путем диспергирования 3,00 г хитозана/ХтзГК в 20 мл воды, растворения в 12 мл 5 %-й уксусной кислоты и доведения объема до 60 мл водой. Значение pH полученного раствора хитозана/ХтзГК доводили до ≤ 5,60 с помощью NaOH. Добавляли 6 мл 1 %-го раствора ферментного комплекса целлюлазы (6000 ед/мл) и ксиланазы (1700 ед/мл) и инкубировали смесь в течение 24 ч при температуре 50 °C. Реакцию останавливали кипячением в течение 10 мин для денатурации ферментов, которые затем удаляли фильтрацией. Фильтрат концентрировали примерно до 1/20 на роторном испарителе при пониженном давлении. Затем добавляли достаточное количество спирта. Выход полученных образцов определяли гравиметрически.
Определение характеристической вязкости и молекулярной массы осуществляли следующим образом. Для растворения хитозана и ХтзГК в качестве растворителя применяли водный раствор 1 %-й уксусной кислоты, для растворения хитоолигосахаридов – дистиллированную воду.
Молекулярную массу (ММ) полученных образцов рассчитывали по уравнению Марка –Хаувинка – Куна
[η] = KмMα,
где [η] − характеристическая вязкость; М − молекулярная масса; Kм и α – эмпирические константы.
Литературные значения констант K и α составляют 1,81 · 10–4 и 0,93 соответственно [10].
Характеристическую вязкость (ХВ) растворов хитозана, ХтзГК и хитоолигосахаридов определяли в модифицированном вискозиметре «Убеллоде» (СКБ «Пущино», Россия) с диаметром капилляра 0,3 мм при 25 °С (точность измерения ± 0,1 с). Значения характеристической вязкости рассчитывали двойной графической экстраполяцией зависимости lnηотн/С от бесконечного разбавления [11].
Степени деацетилирования (СД) определяли методом потенциометрического титрования, описанным в работе [12].
Для статистической обработки данных использованы пакеты анализа Microsoft Excel 2021 (Microsoft, США). Эксперименты проводились в 3 повторностях. Различия между средними значениями считали статистически значимыми при p-value < 0,05.
Результаты и их обсуждение. Известно, что хитиназа, хитозаназа и лизоцим способны гидролизовать частично N-ацетилированные хитозаны, при этом ферментативный гидролиз сопровождается преимущественным образованием димеров, тримеров и тетрамеров N-ацетил-D-глюкозамина. Хитозан также может расщепляться другими неспецифическими ферментами, такими как липаза, папаин, пектиназа и протеаза. Показано, что хитозан может подвергаться биотрансформации до хитоолигосахаридов со степенью полимеризации от 3 до 11 за счет воздействия целлюлазы, что является перспективным направлением в первую очередь, с экономической точки зрения. Стоимость целлюлазы значительно ниже стоимости вышеупомянутых ферментов [13].
Схема получения ХОС из хитозана и ХтзГК представлена на рисунке.
Согласно разработанной схеме, для получения ХОС может использоваться как хитозан, полученный из панцирей ракообразных, так и хитозан-глюкановый комплекс из биомассы высших грибов.
Ферментативный гидролиз хитозана и ХтзГК проводился в течение 24 ч при температуре 50 °C, pH 5,0 и использовании 1 %-го раствора ферментного комплекса целлюлазы и ксиланазы. Установлено, что ферментный комплекс оказывает значительное влияние на деполимеризацию хитозана и ХтзГК.
После 24-часового инкубирования полимеров с целлюлазой и ксиланазой из реакционной смеси отбирали образец, в который при перемешивании добавляли щелочной раствор (1 М NaOH). Отсутствие образования осадка свидетельствовало о деполимеризации хитозана с образованием низкомолекулярных олигомеров. Полученные результаты подтверждаются данными работы [13], в которой в масс-спектрах гидролизатов обнаружены пики, соответствующие массовым числам (M + Na)+ тримера тетрадекасахарида. Продукты реакции представлены преимущественно хитоолигосахаридами с преобладанием фракций со степенью полимеризации 3–11.
Сравнительный анализ процессов ферментативной деполимеризации хитозана и хитозан-глюкановых комплексов позволил оценить влияние природы исходного субстрата на характеристики получаемых хитоолигосахаридов. Физико-химические свойства образцов хитозана, ХтзГК и полученных из них ХОС, представлены в таблице 1. Процесс ферментативного получения ХОС из хитозан-глюкановых комплексов высших грибов характеризуется исключением стадий агрессивной деминерализации и депротеинизации, что отличает его от традиционной технологии переработки панцирей ракообразных. Ферментативная обработка хитозана позволяет получать более чистые хитоолигосахариды, тогда как гидролиз хитозан-глюкановых комплексов приводит к образованию смеси хитоолигосахаридов и β-глюкоолигосахаридов, обладающей потенциально более высокой биологической активностью.
Схема получения хитоолигосахаридов из хитозана и хитозан-глюканового комплекса
Schematic diagram of chito-oligosaccharide production from chitosan and chitosan-glucan complex
Таблица 1
Физико-химические свойства образцов хитозана, ХтзГК и полученных из них ХОС
Physicochemical properties of chitosan samples, chitosan-glucan complexes, and chito-oligosaccharides derived from them
|
Образец |
Характеристическая вязкость, дл · г–1 |
Молекулярная масса, кДа |
Степень деацетилирования, % |
Выход, % от сухого вещества |
|
ХОС из ХтзГК |
3,8±0,2 |
3,2±0,3 |
73,6±3,4 |
78,4±1,3 |
|
ХОС из хитозана |
4,1±0,3 |
5,4±0,6 |
91,5±2,9 |
94,5±1,6 |
|
ХтзГК |
20,8±2,1 |
45,4±2,1 |
66,7±2,3 |
10,2±0,8 |
|
Хитозан |
44,5±1,9 |
113,6±4,2 |
88,2±3,1 |
– |
Результаты исследований продемонстрировали, что выход ХОС из хитозана превышал выход ХОС из ХтзГК на 16,1 %. В ходе исследования физико-химических свойств хитозана, хитозан-глюкановых комплексов и хитоолигосахаридов установлено, что наибольшими показателями характеристической вязкости (44,5 дл · г–1), молекулярной массы (113,6 кДа) и степени дезацетилирования (88,2 %) обладает коммерческий хитозан. При проведении сравнительной оценки с ХтзГК из биомассы грибов выявлены значительные отличия по этим показателям. У ХтзГК значения ХВ, ММ и СД ниже на 53, 60 и 24 %.
Физико-химические свойства ХОС из хитозана и ХтзГК также отличались. Значения ХОС из хитозана превышали значения ХОС из ХтзГК по ХВ на 7,3 %, ММ на 40,7 и СД на 19,5 %.
Следующим этапом являлось исследование пребиотических свойств полученных ХОС при добавлении их в питательные среды (табл. 2).
Таблица 2
Зависимость концентрации молочнокислых бактерий от содержания в питательной среде источников углеводов при глубинном культивировании
Dependence of lactic acid bacteria concentration on the content of carbohydrate sources in the nutrient medium during submerged cultivation
|
Источник углевода в питательной среде |
Пробиотические штаммы, КОЕ/мл |
||||
|
L. acidophilus |
L. casei |
L. rhamnosus |
L. plantarum |
B. bifidum |
|
|
Глюкоза |
1,44 · 109 |
1,61 · 109 |
1,78 · 109 |
1,36 ·109 |
2,42 · 109 |
|
ХОС из ХтзГК |
5,88 · 106 |
5,94 · 106 |
2,54 · 106 |
3,83 · 106 |
5,38 · 106 |
|
ХОС из хитозана |
2,38 · 108 |
2,51 · 108 |
4,47 · 108 |
4,57 · 108 |
7,04 · 108 |
|
ХтзГК |
8,7 · 105 |
1,34 · 105 |
3,23 · 105 |
5,98 · 105 |
7,94 · 105 |
|
Хитозан |
1,28 · 106 |
1,01 · 106 |
1,22 · 106 |
1,03 · 106 |
2,04 · 106 |
В результате проведенных исследований установлено, что молочнокислые бактерии показывают максимальный рост на питательной среде, содержащей ХОС из хитозана, достигая наибольших значений от 2,38 до 7,04 · 108 КОЕ/мл. Культивирование штаммов на среде с хитозаном показало более низкие значения КОЕ/мл: от 1,01 до 2,04 · 106.
Необходимо отметить, что хитозан с невысокой молекулярной массой является стимулятором роста молочнокислых бактерий. Однако он может вызывать ингибирование микроорганизмов за счет своей выраженной антибактериальной активности, которая усиливается при достижении высокой молекулярной массы [14].
ХОС имеют меньший размер молекул, чем хитозан, и следовательно, меньшую вязкость и большую растворимость в водных растворах, что усиливает их пребиотические свойства. Пробиотические бактерии (Lactobacillus, Bifidobacterium) эффективно гидролизуют β-(1→4)-гликозидные связи ХОС до моносахаридов, которые интегрируются в центральный углеродный метаболизм, обеспечивая энергетические и пластические потребности клетки. Одновременно ХОС функционируют как сигнальные молекулы, индуцирующие экспрессию специфических оперонов утилизации и стимулирующие синтез защитных экзополисахаридов, что повышает резистентность бактерий к стрессовым факторам желудочно-кишечного тракта. Ключевым элементом селективности является способность пробиотических микроорганизмов ферментировать ХОС с активной продукцией короткоцепочечных жирных кислот, что приводит к локальному снижению pH и редокс-потенциала среды, создавая условия, благоприятные для развития полезной микрофлоры и подавляющие рост патогенных конкурентов.
Полученные экспериментальные данные с использованием в качестве компонентов питательной среды хитозана и полученных из него ХОС незначительно отличались от результатов культивирования на питательной среде с глюкозой. В то же время рост на питательных средах с ХтзГК и ХОС из ХтзГК показал более низкие значения от 1,34 до 8,7 · 105 и от 2,54 до 5,94 · 106 КОЕ/мл. Это обусловлено тем, что в структуре хитозан-глюканового комплекса присутствуют α- и β-глюканы, которые могут ингибировать рост бактерий [15]. Установлено, что ХОС с более высокой молекулярной массой также ингибируют рост многих молочнокислых бактерий [16].
Морфологические характеристики клеток пробиотических штаммов бактерий при культивировании на исследуемых питательных средах различного состава существенно не отличались.
Таким образом, проведенные исследования показывают перспективность использования ферментного препарата «Целлолюкс-А» при получении ХОС, обладающих пребиотическими свойствами, как из хитозана ракообразных, так и из хитозан-глюкановых комплексов высших грибов.
Заключение
- Впервые доказана высокая эффективность применения доступного ферментного препарата «Целлолюкс-А» (целлюлаза – 6000 ед/мл, ксиланаза – 1700 ед/мл) для получения хитоолигосахаридов из различных источников. Показано, что этот подход является экономически выгодной альтернативой использованию специфических, дорогостоящих ферментов (хитиназы и хитозаназы), недоступных для промышленного получения ХОС. Экономическая эффективность метода обусловлена низкой стоимостью препарата «Целлолюкс-А» (широко используется в сельском хозяйстве и пищевой промышленности), упрощением и ускорением технологического процесса за счет использования мягких и легко контролируемых условий неспецифического ферментативного гидролиза (температура – 50 °C, pH – 5,0, время – 24 ч) и возможностью применения стандартного производственного оборудования. Полученные результаты открывают перспективу для масштабирования технологии получения ХОС с заданными функциональными свойствами.
- Комплексно изучены физико-химические свойства образцов хитозана из ракообразных, хитозан-глюкановых комплексов из биомассы высших грибов и полученных из них хитоолигосахаридов. Установлено, что ХОС, полученные из хитозана, характеризуются более высокими показателями характеристической вязкости (4,1 дл · г⁻¹), молекулярной массы (5,4 кДа) и степени деацетилирования (91,5 %), что превышает соответствующие значения для ХОС из хитозан-глюканового комплекса грибов Ganoderma lucidum на 7,9 %, 68,8 и 24,3 % соответственно. Выявлены корреляционные зависимости между этими показателями и пребиотической активностью: оптимальный баланс молекулярной массы (3–6 кДа) и высокая степень деацетилирования (> 90 %) обеспечивают максимальную биодоступность и усвояемость олигосахаридов пробиотическими микроорганизмами. При этом выход ХОС из хитозана (94,5 %) значительно превышает выход из ХтзГК (78,4 %), что дополнительно подтверждает технологическую эффективность данного подхода.
- Впервые проведена комплексная оценка пребиотической активности хитозана, хитозан-глюкановых комплексов и хитоолигосахаридов в отношении пяти ключевых для пищевой промышленности пробиотических штаммов. Установлено, что ХОС из хитозана проявляют выраженную стимулирующую активность в отношении всех тестированных штаммов, особенно Bifidobacterium bifidum. При добавлении ХОС в питательную среду количество колониеобразующих единиц на мл составило для L. acidophilus – 2,38 · 108; L. casei – 2,51 · 108; L. rhamnosus – 4,47 · 108; L. plantarum – 4,57 · 108; B. bifidum – 7,04 · 108. ХОС из ХтзГК показали более низкую пребиотическую активность (2,54–5,88 · 106 КОЕ/мл) в сравнении с ХОС из хитозана. Выявлены значительные различия в эффективности ХОС в зависимости от источника их получения: активность ХОС из хитозана превышает активность ХОС из ХтзГК в 37–85 раз, что связано с присутствием в хитозан-глюкановом комплексе грибов α- и β-глюканов, снижающих биодоступность полученных олигомеров. Полученные данные позволяют рекомендовать ХОС с молекулярной массой 5–6 кДа и степенью деацетилирования > 90 % в качестве эффективных пребиотических добавок для функциональных пищевых продуктов.
На основании проведенных исследований разработаны научно обоснованные рекомендации по выбору оптимального сырья и условий получения ХОС с пребиотическими свойствами. Результаты исследования соответствуют приоритетным направлениям развития биотехнологии в Российской Федерации и могут быть использованы для создания отечественных пребиотических препаратов, способствующих решению задач импортозамещения в пищевой и сельскохозяйственной отраслях. Перспективы дальнейших исследований включают изучение in vivo эффектов полученных ХОС, оптимизацию технологических параметров для промышленного производства, а также разработку функциональных пищевых продуктов с использованием синтезированных хитоолигосахаридов. Особый интерес представляет исследование синергетического действия ХОС из хитозана и β-глюканов из грибов, которое может расширить спектр их биологической активности и повысить эффективность применения в профилактике метаболических нарушений и заболеваний желудочно-кишечного тракта.
