Введение. В аквакультуре при разведении и выращивании рыбы часто приходится сталкиваться с нарушением целостности и инфицированием ее кожных покровов при перевозке, сортировке, уплотненной посадке. С целью лечения и профилактики применяют антибиотики, которые вводят в организм рыб с помощью лечебных ванн, инъекций или с кормами перорально [1, 2].
В последнее время с развитием нанотехнологий для точной доставки лекарственных средств в организм животных стали использовать различные наночастицы. Одной из таких новейших разработок являются комплексы производных β-циклодекстринов (ЦД) [3–11]. Производные β-циклодекстринов вследствие крошечного размера и пористой природы могут связывать малорастворимые препараты в пределах их матрицы и повышать их растворимость, стабильность и биодоступность [2, 3]. Но при этом необходимо учитывать, что сочетание циклодекстриновых носителей с различными полимерами с большим количеством ковалентных внутримолекулярных связей может обуславливать изменение свойств препарата по сравнению с простым комплексом лекарство-ЦД [12, 13].
Одним из возможных компонентов такого комплекса выступает гетерополисахарид хитозан, характеризующийся хорошей водорастворимостью, биосовместимостью и биоразлагаемостью, мукоадгезией, антимикробной активностью [14–17]. Все эти свойства хитозана делают его привлекательным для применения в сельском хозяйстве и ветеринарии. В связи с этим научные изыскания по созданию и повышению эффективности таких циклодекстриновых лекарственных комплексов с антибиотиками в терапии промысловых рыб являются актуальными.
В качестве антиотибиотиков, помещающихся в пористой структуре комплексов производных β-циклодекстринов, могут выступать фторхинолоны II поколения, действующие против инфекций различных этиологий [13, 18], в том числе возбудителей инфекционных поражений резаных, ожоговых и других видов ранений и повреждений наружных покровов.
В отечественной аквакультуре широко применяется ципрофлоксацин, в свою очередь левофлоксацин, также относящийся к фторхинолонам, является новым, недостаточно изученным средством для лечения рыб, но перспективным, поскольку резистентность к применяемым в аквакультуре антибиотикам у рыб – достаточно распространенное явление [19–21].
Цель исследования – изучение влияния комплексов хитозан-β-циклодекстрин с иммобилизованным левофлоксацином на некоторые микробиологические показатели резаных ран и толстого кишечника сомов.
Задачи: определить влияние комплексов хитозан-ß-циклодекстрин, содержащих 10, 15 или 20 % левофлоксацина, на общее микробное число (ОМЧ) резаных ран, общее микробное число и количество молочнокислых бактерий толстого кишечника сеголеток африканского лабиринтового сома в динамике.
Объекты и методы. Эксперимент проводился в научно-исследовательской лаборатории «Прогрессивные биотехнологии в аквакультуре» ФГБОУ ВО «Вавиловский университет» в условиях аквариумной установки. Влияние комплексов β-циклодекстринов с разной концентрацией левофлоксацина на течение инфекционного процесса и заживление резаных ран рыб исследовали на сеголетках африканского лабиринтового сома – Clarias gariepinus (Burchell, 1822). Согласно принципам рациональной антибиотикотерапии и для поиска наименьшей эффективной концентрации в работе использовались комплексы с разным содержанием антибиотика. Исследуемые комплексы β-циклодекстринов были синтезированы на кафедре «Химическая энзимология» МГУ им. М.В. Ломоносова и представляли собой порошок светло-желтого цвета, добавляемый в корм рыбам.
Для проведения исследований методом пар-аналогов были сформированы 5 групп сомов (n = 10), размещенные в аквариумах: 1-я контрольная (К1), в которой рыбы получали сбалансированный корм (ОР); 2-я контрольная (К2) с модельным нарушением пищеварения и дисбиозом кишечника за счет приема корма с перекисным числом 24,68 ± 2,22 (ОРН); 1-я опытная, в которой рыбы получали качественный сбалансированный корм по питательным веществам с добавлением циклодекстринового комплекса с 20 %-м содержанием антибиотика; 2-я опытная, рыбы которой также получали качественный сбалансированный корм с добавлением циклодекстринового комплекса с 15 %-м содержанием антибиотика, и 3-я опытная группы, где для лечения применялись комплексы с 10 %-м содержанием левофлоксацина.
Сомов содержали в аквариумах объемом 250 л; температура воды – 26,0–27,0 °С; уровень растворенного в воде кислорода – 7,0 мг/л; рН – 7,8; прозрачность воды – 45,0–50,0 см; частота замены воды в аквариуме – 250 л в сутки. Гидрохимический режим был одинаков во всех группах и являлся оптимальным для выращивания сомов. Продолжительность эксперимента составила 14 дней. Корм с циклодекстриновым лекарственным комплексом рыбы получали ежедневно три раза в день. Особи контрольных групп (К1 и К2) изучаемые комплексы не получали, рыбы 2-й контрольной группы в течение всего опыта продолжали получать некачественный корм. Исследование проводили по схеме, представленной в таблице 1.
Таблица 1
Схема опыта
The scheme of experience
|
Группа |
Состояние кожного покрова рыбы |
Тип кормления |
|
К1 |
Повреждена |
Основной рацион качественный корм (ОР) |
|
К2 |
Повреждена |
Основной рацион некачественный корм (ОРН) |
|
1-я опытная |
Повреждена и получает лечение |
ОР + комплекс с 20 % левофлоксацина |
|
2-я опытная |
Повреждена и получает лечение |
ОР + комплекс с 15 % левофлоксацина |
|
3-я опытная |
Повреждена и получает лечение |
ОР + комплекс с 10 % левофлоксацина |
Раны моделировали, делая надрезы мышц спины в области спинного плавника длиной 2 см и глубиной 0,5 см. Для определения количества микрофлоры смывы с поверхности ран (2×0,5 см) брали стерильными ватными тампонами, а содержимое из толстого кишечника извлекали в стерильных условиях после вскрытия рыбы. Общее микробное число в смывах с ран, ОМЧ и количество молочнокислых бактерий в кишечнике рыб определяли методом последовательных разведений [22] на мясо-пептонном агаре (МПА) (НИЦФ, Россия) и на лактобакагаре (ФБУН ГНЦ ПМБ, Оболенск, Россия). Посевы на МПА и лактобакагаре культивировали 72 ч в термостате при 32 и 37 °С соответственно, а далее подсчитывали число выросших колоний.
Статистическую обработку полученных данных осуществляли по стандартным методикам [23] с помощью программных пакетов MS Excel и Statistica 6.0. Использовали параметрический t-критерий Стъюдента и критерий Колмогорова – Смирнова для проверки соответствия анализируемых данных нормальному распределению. Достоверными считали различия при вероятности ошибки р ≤ 0,05.
Результаты и их обсуждение. При сравнительном анализе влияния комплексов хитозан-ß-циклодекстринов с различным содержанием левофлоксацина на микрофлору резаных ран сомов было установлено существенное снижение ОМЧ резаных ран сеголеток сомов (табл. 2).
Таблица 2
Влияние комплекса хитозан-ß-циклодекстрин с левофлоксацином
на микрофлору резаных ран сомов (M±m)
The effect of the chitosan-ß-cyclodextrin complex with levofloxacin
on the microflora of cut wounds of catfish (M±m)
|
Группа |
ОМЧ, КОЕ/мл |
||
|
Сутки |
|||
|
1-е |
8-е |
14-е |
|
|
К1 |
1,0∙104±0,4 |
1,0∙104±0,4 |
1,0∙104±0,4 |
|
К2 |
3,0∙104±0,8 |
1,0∙104±0,4● |
1,0∙105±0,8*■● |
|
1-я опытная |
1,0∙104±0,4 |
1,0∙103±0,4*●˚ |
1,0∙103±0,4*■● ˚ |
|
2-я опытная |
1,0∙104±0,4 |
1,0∙103±0,4*●˚▲ |
1,0∙103±0,4*■ ●˚ |
|
3-я опытная |
1,0∙104±0,4 |
1,0∙104±0,4▲◊ |
1,0∙103±0,4*■●˚ |
Примечание: р ≤ 0,05 относительно *значения 1-х сут в своей группе; ■ значения 8-х сут в своей группе; ● относительно значения в группе К1 в эти же сутки; ˚ относительно значения в группе К2 в эти же сутки; ▲ значения в 1-й опытной группе в эти же сутки; ◊ значения во 2-й опытной группе в эти же сутки.
В смывах с ран рыб контрольных групп количество микроорганизмов вплоть до 14-го дня наблюдения не снижалось (К1) и даже возрастало (К2), что свидетельствует о продолжении и развитии инфекционного процесса. К окончанию эксперимента ОМЧ во второй контрольной группе было в 10 раз больше по сравнению с таковым 1-й контрольной, что подтверждает влияние качества корма на рост и развитие микрофлоры ран рыб.
Количество микрофлоры в ранах опытных групп в 1-е сут было сопоставимо с ее числом в обеих контрольных группах, поскольку условия моделирования ран для всех рыб были идентичны, а исследуемые препараты не успели оказать лечебного воздействия.
Эффективное подавление микрофлоры ран, в т. ч. условно-патогенной, к 8-м сут наблюдали в опытных группах с 20 и 15 %-м содержанием антибиотика – в 10 раз по сравнению с 1-ми сут. Эта тенденция сохранялась к концу эксперимента к 14-м сут. У рыб третьей опытной группы, получавших минимальную концентрацию фторхинолона, уровень ОМЧ на 8-е сут был сопоставим с результатами в группах К1 и К2, а на 14-е сут – различий с 1-й и 2-й опытными группами не было. Известно, что в составе микрофлоры воды преобладают бактерии родов Pseudomonas, Aeromonas, Flavobacterium, Proteus, Bacillus и семейства Enterobacteriacea [24]. Эти представители условно-патогенной микрофлоры участвуют в развитии инфекционного процесса при нарушении целостности кожного покрова у различных сельскохозяйственных животных [25–29], очевидно, что они же участвуют в развитии воспаления у гидробионтов, а общая плотность бактерий влияет на скорость заживления.
Результаты исследования кишечной микрофлоры сомов при применении для заживления ран комплексов с левофлоксацином представлены в таблице 3.
Таблица 3
Влияние комплекса хитозан-ß-циклодекстрин с левофлоксацином
на микрофлору толстого кишечника сомов (M ± m)
The effect of chitosan-ß-cyclodextrin complex with levofloxacin
on the microflora of the large intestine of catfish (M ± m)
|
Группа |
ОМЧ, КОЕ/г |
Молочно-кислые бактерии, КОЕ/г |
ОМЧ, КОЕ/г |
Молочно-кислые бактерии, КОЕ/г |
ОМЧ, КОЕ/г |
Молочно-кислые бактерии, КОЕ/г |
|
Сутки |
||||||
|
1-е |
8-е |
14-е |
||||
|
К1 (хор) |
1,0∙106±0,4 |
1,0∙102±0,4 |
1,0∙106±0,5 |
1,0·103±0,3● |
1,0·106±0,4 |
1,0·104±0,3● |
|
К2 (плох) |
– |
– |
1,0·107±0,3 ●* |
1,0·102±0,1 * |
1,0·107±0,8 ●* |
1,0·102±0,2 * |
|
1-я опытная |
– |
– |
1,0·105±0,3 ●*▲ |
1,0·102±0,1 * |
1,0·104±0,1 ●*▲ |
1,0·103±0,8 ●▲ |
|
2-я опытная |
– |
– |
1,0∙105±0, ●*▲ |
1,0·102±0,1 * |
3,0·105±0,4 ●*▲ |
1,0·104±0,1 ●▲ |
|
3-я опытная |
– |
– |
1,0∙106±0,3 ▲˚ ◊ |
1,0·103±0,1 ●*▲◊ |
1,0·105±0,4 ●*▲ |
1,0·104±0,4 *●▲˚ ◊ |
Примечание: р ≤ 0,05 относительно ●значения 1-х сут в группе К1; *относительно значения в группе К1 в эти же сутки; ▲относительно значения в группе К2 в эти же сутки; ˚ значения в 1-й опытной группе в эти же сутки; ◊ значения во 2-й опытной группе в эти же сутки; «–» исследование не проводилось.
При исследовании кишечной микрофлоры сомов наблюдали прямую зависимость количества микроорганизмов от концентрации антибиотика. В 1-й и 2-й опытных группах, получавших 20 и 15 % дозу антибиотика, уже к 8-м сут ОМЧ толстого кишечника было в 10 раз ниже контрольной группы К1, питавшейся качественным кормом. Количество молочнокислых бактерий в этих группах было в 10 раз ниже относительно К1 и аналогично К2, что объясняется антимикробным действием лекарственного препарата. У рыб 3-й опытной группы, получавших комплекс с 10 %-м содержанием антибиотика, результат при подсчете ОМЧ и молочнокислых бактерий был аналогичен результату во 2-й контрольной группе, питавшейся некачественным кормом.
В конце исследования наибольшую подавляющую активность проявил образец с наибольшим содержанием левофлоксацина. Во 2-й и 3-й опытных группах спустя 14 сут применения циклодекстриновых комплексов общее количество микроорганизмов и количество молочнокислых бактерий среди них одинаково, а относительно 1-й опытной группы выше в 10 раз. В контрольных группах без лечения ОМЧ было значительно выше опытных, при этом доля полезных молочнокислых бактерий среди них ниже, чем в опытных, что также свидетельствует о влиянии рациона питания рыб и качества корма на нормофлору кишечника при заболеваниях, сопровождающихся инфекционным процессом, в т. ч. повреждения кожи.
Сравнительный анализ количества молочнокислых бактерий в опытных группах в конце исследования показал, что доля молочнокислых бактерий в ОМЧ выше исходных данных, полученных при моделировании нарушения пищеварения, что свидетельствует об эффективности применения комплексов не только для заживления ран, но и для восстановления состава микрофлоры при дисбиозах.
Заключение. При исследовании эффективности комплексов хитозан-β-циклодекстрин с левофлоксацином в отношении микрофлоры, населяющей раны покровов и кишечник сомов, установлено их значительное участие в заживлении ран рыб. Об этом свидетельствует уменьшение ОМЧ ран и кишечника рыб к концу эксперимента во всех опытных группах с лечением по сравнению с контрольными. Результаты исследования показали, что все комплексы хитозан-β-циклодекстрин с различным содержанием левофлоксацина эффективны в отношении микрофлоры резаных ран сомов. В отношении кишечной микрофлоры наибольшую подавляющую активность на конец исследования проявил образец с 20 %-м содержанием левофлоксацина. Доля молочнокислых бактерий в ОМЧ в опытных группах в конце исследования возросла относительно начала применения лечебных комплексов, что свидетельствует об эффективности применения комплексов не только для заживления ран, но и для восстановления состава микрофлоры при дисбиозах. Лечебное действие комплексов усиливалось применением качественного корма, поскольку количество молочнокислых бактерий в 1-й контрольной группе, питавшейся также качественным кормом, было сопоставимо с опытными группами. В 1-й контрольной группе ОМЧ в 10 раз был выше опытных, что свидетельствует о подавляющем влиянии лечебных препаратов на нормофлору кишечника. Результаты исследования в перспективе применимы для лечения и профилактики инфекционных заболеваний при выращивании рыб.



