Введение. В настоящее время УФ-С (до 280 нм) поглощается озоновым слоем Земли и не достигает поверхности, но данное излучение может использоваться в искусственных агроэкосистемах и системах послеуборочной обработки с целью повышения содержания целевых метаболитов. Применение УФ-спектра света для выращивания и обработки растениеводческой продукции относится к экологически чистому фактору воздействия [1].
Повышение содержания продуктов вторичного обмена в растениеводческой продукции важно для поддержания здоровья человека [2]. Изменение в составе растений может оказывать воздействие на развитие вредителей и болезней [3].
Световые факторы могут являться оптимальными, а могут и оказывать относительно неблагоприятное воздействие как на онтогенез растительного организма в целом, так и на процессы метаболизма на клеточном уровне [4, 5]. В растениях разные по природе виды воздействий – УФ-излучение, патогены и механические повреждения – часто ведут к активации ряда идентичных генов; воздействие одного фактора, с большой долей вероятности, отражается в устойчивости к другим неблагоприятным воздействиям [6].
Облучение биологических объектов УФ-С спектром радиации для подавления патогенной микрофлоры может применяться как при послеуборочном воздействии на сами растения, так и на их плоды [7]. Обработка УФ-С может задерживать старение плодов, снижать скорость дыхания за счет инактивации ферментативной активности, повышения содержания перекиси водорода и способности поглощать свободные радикалы, способствует повышению уровня содержания глутатиона, аскорбиновой кислоты и фенольных соединений [8]. УФ-С снижает частоту и степень гниения плодов, потерю массы при длительном хранении, уровень перекисного окисления липидов, повышает содержание общего растворимого твердого вещества и титруемой кислотности в плодах [9] соединений группы флавоноидов, дубильных веществ, лигнина [10] псоралена, бергаптена [11], сахарозы, глюкозы, фруктозы [12], тетрагидроканнабинола [13] катехина, лютеолина, а также фенольных кислот: галловой, коричной и феруловой [14]. Фенольные соединения предположительно обладают защитными свойствами, и их содержание может быть увеличено в ответ на УФ-С воздействие [15]. Обработка плодов УФ-С стимулирует процессы лигнификации и суберинизации и биосинтез фенольных соединений в клеточной стенке.
В условиях засухи, дефицита питательных веществ чувствительность к УФ-С снижается, а при снижении интенсивности видимого спектра излучения чувствительность возрастает [16].
Воздействие УФ усиливает активность фенилаланин-аммиак-лиазы, фермент, который является ключевым в метаболизме фенилпропаноидов, вследствие чего биосинтез фенольных соединений увеличивается. Применение УФ-С при воздействии носит регуляторный характер [17].
Ранее было показано, что существует возможность воздействия УФ-С на ценные компоненты вторичного биосинтеза стевии: содержание кверцетина и стевиолгликозидов [18]. Количество кверцетина может меняться при воздействии УФ на растение. Кверцетин выступает компонентом системы эндогенной защиты тканей растения от ультрафиолетового излучения, может действовать как антиоксидант [19]. Присутствие сравнительно высоких доз УФ-излучения преимущественно меняет фенотип растения, вызывая замедление роста, накопление общей биомассы и уменьшение площади листьев, хотя толщина листовых пластинок увеличивается. УФ оказывает влияние на устьица, делая их более устойчивыми к недостатку влаги, снижая у неустойчивых к УФ видов содержание хлорофилла [5].
Цель исследования – изучить влияние добавленного к основному излучению в области ФАР-облучения растений УФ-С спектром на синтез и аккумуляцию стевиолгликозидов и кверцетина в листьях черенков стевии в процессе вегетативного размножения, а также у взрослых растений.
Объекты и методы. Для черенкования использовали вегетативные побеги стевии от маточных растений возрастом 120 дней. Нарезали черенки с тремя междоузлиями, площадь листьев в двух верхних узлах при этом сокращали на 50 %. Нижний косой срез (без листьев) перед посадкой обрабатывали в порошке препарата «Корневин». Черенки для укоренения были высажены в 0,5-литровые полимерные горшки, наполненные нейтрализованным верховым торфом «Агробалт С» (ОАО «Росторфинвест»), первоначально нейтрализованным и заправленным удобрениями производителем. Для укоренения и сохранения влаги черенки укрывали прозрачной пленкой, через 14 дней пленка удалялась. На тридцатый день примерно 50 % черенков стевии отметили успешное развитие корневой системы и провели выбраковку неприжившихся растений. Также в условиях проведения опыта на соответствующие варианты световых режимов были помещены взрослые растения стевии с хорошо развитыми вегетативными побегами возрастом 120 дней.
Исследования проводили в климатической камере СК-ВИМ-8.8, изготовленной и расположенной в ФГБНУ ФНАЦ ВИМ. В камере автоматически поддерживались: влажность воздуха 50 %, температура днем – 22 °С, ночью – 19 °С, полив и подкормку проводили вручную; фотопериод – 16 ч. Относительно длинный день благоприятствовал преимущественно вегетативному развитию растений.
Камера оборудована шестью стеллажами, расположенными в два яруса, три полки в верхнем ярусе, три в нижнем. Полки отделены перегородками, образуя 6 отсеков. Облучение полок обеспечивалось комбинацией светодиодов с излучением в области ФАР. Верхние ярусы, без УФ-С, – основное базовое освещение (Л1, Л2, Л3), его интенсивность составила 140 ± 8 мкмоль/м2с, что является минимально достаточным для нормального развития растений (табл. 1, рис. 1–3).
Спектр оптического излучения Л1 (С14З40К42ДК4) приближен к солнечному свету, имеет наибольшую долю зеленого спектра и взят за контроль. Спектр Л2 (С20З20К53ДК7) имеет немного большую долю синего и красного спектров. Спектр Л3 (С23З4К54ДК19) имеет еще большее излучение в области синего и красного и дальнего красного спектров. Измерения спектрального состава излучения и PPFD проводили спектрометром MK350D Compact Spectrometer (Taiwan).
На нижнем ярусе стеллажей облучатели были дополнены диодами УФ-С, со спектром (Л1+УФ-С, Л2+УФ-С, Л3+УФ-С). Облучатель УФ-С спектра представлял собой алюминиевый радиатор с прикрепленными печатными платами со светодиодами. Диоды УФ-С спектра были включены на 30-й день вегетации черенков и работали ежедневно в течение двух часов с периодом работы: 20 секунд – излучение, 120 секунд – пауза, интенсивность – 50 мВт/м2. Одновременно с началом действия режимов с дополнительным УФ-С излучением на них наряду с расчеренкованными были перенесены и взрослые растения.
Рис. 1. Спектральный состав основного света Л1
Spectral composition of the main light L1
Рис. 2. Спектральный состав основного света Л2
Spectral composition of the main light L2
Рис. 3. Спектральный состав основного света Л3
Spectral composition of the main light L3
Таблица 1
Спектральные характеристики источников облучения
Spectral characteristics of radiation sources
|
Вариант освещения |
Соотношение спектров в общем потоке фотонов, % |
УФ-C 275 nm, мВт/м2 |
||||
|
ППФД, мкмоль м−2с−1 |
Синий 400–500 nm |
Зеленый 500–600 nm |
Красный 600–700 nm |
Дальний красный 700–800 nm |
||
|
Л1 |
140±8 |
14 |
40 |
42 |
4 |
– |
|
Л1+УФ-С |
140±8 |
14 |
40 |
42 |
4 |
50–60 |
|
Л2 |
140±8 |
20 |
20 |
53 |
7 |
– |
|
Л2+УФ-С |
140±8 |
20 |
20 |
53 |
7 |
50–60 |
|
Л3 |
140±8 |
23 |
4 |
54 |
19 |
– |
|
Л3+УФ-С |
140±8 |
23 |
4 |
54 |
19 |
50–60 |
Определение биометрических показателей. Для определения сырой и сухой биомассы, а также высоты и площади листьев отбирали по четыре растения из каждого варианта.
Высота растения определялась линейкой (ГОСТ 17435-72) и вычислялась как среднее среди вновь развитых в ходе эксперимента побегов из черенков.
Подсчет листьев выполнялся вручную, во внимание принимались хорошо развитые листья, размером более 1 см2.
Определение площади листьев проводили на фотопланиметре Li-Cor LI-3100 (США).
Для определение сырой и сухой массы растения взвешивали на лабораторных весах GF-3000 (A&D Company, Япония). Для определения сухой массы растений использовали побеги и листья после высушивания в сушильном шкафу ПЭ-4630М (Россия) при температуре 105 °С.
Измерение биохимических показателей. Для определения собирали все листья с каждого растения отдельно, высушивали при 60 °С в течение 4 часов и измельчали в фарфоровой ступке.
Количественное определение кверцетина. Навеску массой 0,3 г помещали в коническую колбу, приливали 30 мл этилового спирта и 0,15 мл серной кислоты, на верх колбы помещали холодильник Димрота и кипятили при температуре 78,4 °С в течение 30 мин. После охлаждения доводили до объема 50 мл этиловым спиртом. Затем помещали в ультразвуковую ванну Elmasonic S10 на 5 мин. После отстаивания растворы фильтровали с помощью фильтровальной бумаги «синяя лента», а затем пропускали через шприцевую фильтрующую насадку (размер пор 0,45/25) и отбирали аликвоту объемом 1 мл и переносили в подписанную виалу.
Концентрацию кверцетина определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на жидкостном хроматографе Shimadzu LC-20AD со спектрофотометрическим детектором. Для идентификации пика и определения времени выхода компонента использовали стандартный образец кверцетина (Sigmaaldrich CAS 849061-97-8). Разделение проводили на обратнофазной колонке С18 Luna 250*4.6 мм. Детектирование проводилось при длине волны 358 нм. Скорость потока элюента составляет 1 мл/мин, градиент – 50 % ацетонитрила и 50 % сверхчистой деонизированной воды, объем вводимой пробы – 10 мкл. Температура хроматографирования – 35 °С. Продолжительность анализа составляла 20 мин.
Количественное определение суммы стевиолгликозидов. Измельченную, предварительно высушенную навеску листьев 0,05 г заливали 30 мл 50 %-го этанола и кипятили на водяной бане при температуре 82,8 °С 30 мин. После остывания экстракт доводили 50 % этанолом до 50 мл и помещался на 5 мин в ультразвуковую ванну. После чего фильтровали фильтровальной бумагой и пропускали через шприцевой фильтр, отбирали аликвоту объемом 1 мл в подписанную виалу и исследовали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе LC-20 (Shimadzu, Киото, Япония) с использованием обратнофазной колонки С18 Eclipse Plus C18, 4,6 × 150 мм, 5 мкм (Agilent, США). Определение проводили при следующих условиях: скорость потока – 1,0 мл/мин, градиент – 50 % ацетонитрила 50 % сверхчистой деонизированной воды, температура – 30 °C, время анализа – 20 мин, длина волны детектирования – 210 нм. Расчет содержания суммы стевиолгликозидов проводили относительно калибровки с использованием аналитического стандарта на стевиозид (Supelco, США). Затем производили расчет процента суммы стевиолгликозидов на сухую массу.
Статистический анализ. Все исследования проводили в четырех биологических и трех аналитических повторностях. Полученные экспериментальные данные были обработаны и получено графическое представление данных в MS Excel. Результаты выражали как среднее ± стандартное отклонение, различия считали статистически значимыми при р ≤ 0,5.
Результаты и их обсуждение. Вегетативное развитие выросших черенков стевии (увеличение высоты растений, сырой и сухой массы стебля и листьев, а также площади листьев) происходило более быстрыми темпами под источником излучения, наиболее приближенным по своим спектральным характеристикам к солнечному свету (Л1) (табл. 2). Дополнение базовых спектров облучения спектром УФ-С излучения тормозило ростовые процессы и снижало биометрические показатели растений во всех вариантах. Ранее было показано, что ультрафиолетовое облучение влияет на морфологию растений, что может выражаться в задержке роста растений, уменьшении площади листьев и общей биомассы, распределении ассимилянтов, направленных на перераспределение процессов онтогенеза. Чувствительность к ультрафиолету зависит от вида и даже сорта.
В вариантах с УФ-С излучением наблюдали у растений потемнение верхушечных листьев, целиком либо частичное. Ранее отмечалось, что защитной реакцией на травмирующее воздействие УФ-С является проявление хлороза, повреждение начинается с верхнего эпидермиса листьев, который темнеет, вследствие чего проникновение УФ радиации в мезофилл уменьшается [5].
Было отмечено, что обработка невысокими дозами УФ-Б повышает концентрацию хлорофилла, скорость переноса электронов по всей цепи, но снижает фотофосфолирование, и как следствие, падает эффективность фотосинтеза. Чистая скорость фотосинтеза и устьичная проводимость снижаются, но у риса на 25-й день обработки становятся сравнимы с листьями без обработки, подверженными естественному старению. При проведении микроскопии в развивающихся листьях отмечено, что УФ замедлил развитие хлоропластов, в дальнейшем приведя к их разрушению, при этом мембраны хлоропластов набухли и разрушались, а в строме тилакоиды заняли параллельное положение относительно друг друга, что, возможно, способствовало более эффективному протеканию процесса фотосинтеза. Визуально отметили накопление липидных капель и пластоглобул крахмала, что вызвано нарушением транспорта продуктов вторичного обмена [20].
В дальнейшем следует продолжить работу в оценке более эффективной дозы воздействия УФ-С излучения, его времени воздействия на фотосинтетический листовой аппарат стевии, в меньшей степени приводящий к разрушению ассимиляционной ткани.
Процесс реакции растений на ультрафиолет напрямую связан с деструкцией Рубиско. Изменения в инактивации фермента происходят при структурных перестройках больших и малых субьединиц и в целом в четвертичной структуре, что влечет конформацию реакционных центров, расположенных на больших субъединицах, что приводит к снижению активности. Вероятно, происходит димеризация из-за образования ковалентных несульфидных связей между субъединицами. Молекулярная модификация, влекущая снижение активности Рубиско, наблюдается уже в первые 3 ч воздействия ультрафиолетом. При дальнейшем исключении стрессового фактора активность фермента восстанавливается, по-видимому, за счет синтеза и замены поврежденных участков. Фермент в большей степени поглощает в диапазоне УФ-С (250–260 нм), что приводит к его ингибированию на 60 % по сравнению с контрольными значениями, а при УФ 300 нм ингибирование составляет всего 25–35 %. Восстановление после временного воздействия ультрафиолета зависит от его волны и дозы, наиболее сильное приводит не только к изменению структуры Рубиско, но и нарушению его синтеза [21]. Исключение из спектра УФ приводило к повышению уровня Рубиско и увеличению его общей активности [22].
Таблица 2
Биометрические показатели черенков стевии в возрасте 74 дня
Biometric indicators of stevia cuttings at the age of 74 days
|
Вариант освещения |
Высота растения, см |
Сырая масса стебля, г |
Сырая масса листьев, г |
Площадь листовой поверхности, см2 |
Сухая масса листьев, г |
УППЛ, мг/см2 |
|
Л1 |
29,4±2,3 |
8,1±0,5 |
15,3±1,8 |
653,6±15,3 |
2,5±0,2 |
3,8 |
|
Л1+УФ-С |
22,4±4,2 |
7,5±0,7 |
12,4±1,2 |
558,0±17,3 |
2,1±0,1 |
3,7 |
|
Л2 |
25,4±2,1 |
7,9±0,5 |
14,6±1,6 |
642,4±23,8 |
2,2±0,2 |
3,4 |
|
Л2+УФ-С |
21,8±1,5 |
6,9±0,5 |
8,5±1,7 |
389,2±31,2 |
1,1±0,1 |
2,8 |
|
Л3 |
18±1,5 |
5,8±0,3 |
10,4±0,5 |
499,2±15,8 |
1,3±0,1 |
2,6 |
|
Л3+УФ-С |
16,5±2,3 |
4,2±0,2 |
5,4±0,7 |
237,6±16,7 |
0,9±0,1 |
3,7 |
В таблице 3 и на рисунке 4 представлено содержание кверцетина в листьях расчеренкованных растений стевии. Его количество увеличивалось в онтогенезе и было больше на 88-й день по сравнению с 74-м. Если сравнивать варианты с основным освещением (Л1, Л2, Л3) у черенков в возрасте 74 дня максимальное содержание кверцетина было отмечено в варианте Л3 (0,520 мг/100 г). На 88-й день под всеми источниками света, дополненными УФ-С спектром, содержание кверцетина было выше, чем в соответствующих вариантах без дополнительного УФ-излучения.
Наиболее благоприятным для повышения уровня содержания кверцетина у взрослых растений был световой режим Л1, наиболее приближенный к спектру солнечного света. Максимальное содержание кверцетина в варианте Л1 составило 2,172 мг/100 г. У взрослых растений содержание кверцетина было меньше на 24 % под Л2, а под Л3 на 30 % по сравнению с Л1. А добавление УФ-С снижало содержание данного флавоноида в вариантах Л1+УФ-С (на 24 %) и Л2+УФ-С (на (59 %), но добавление УФ-С к Л3 практически не повлияло на содержание кверцетина и составило 1,5 мг/100 г.
Ультрафиолет вызывает повреждение ДНК ядерного, хлоропластного, митохондриального, вызывая цепочечные разрывы и окислительные повреждения, происходящие при репликации ДНК. Соединениями, помогающими преодолеть негативное воздействие УФ, являются флавоноиды, так как они способны поглощать УФ-излучение. Накопление флавоноидов происходит в основном эпидермисе, а также в тканях, подвергшихся воздействию УФ. Флавоноиды могут подвергаться гликозилированию, метилированию, гидроксилированию, ацилированию или пренилированию. Также флавоноиды флавоноиды обладают антиоксидантными свойствами [23]. Биосинтез флавоноидов контролирует фоторецептор UVR8. Он же отвечает за само восприятие ультрафиолетового облучения, так же регулирует различные физиологические процессы: передача сигналов ауксина, ингибирование роста гипокотиля, расширение семядолей, термогенез. UVR8 в виде гомодимера находится в цитозоле, а при воздействии УФ диссоциирует в мономер, перемещается в ядро и влияет на фотоморфогенный ген COP1 [24].
Добавление УФ-С излучения к основному спектру для увеличения содержания кверцетина в активно растущих растениях оказывает высокую способность растений стевии к синтезу защитных соединений и возможности использовать УФ спектр для обогащения флавоноидами. Но снижение и отсутствие реакции в синтезе кверцетина у взрослых растений говорит о сниженном уровне ассимиляции в ответной реакции на добавление УФ в уже развитых листьях стевии.
Таблица 3
Содержание кверцетина в черенках и взрослых растениях стевии
в зависимости от облучения, мг/100 г
The content of quercetin in cuttings and adult stevia plants, depending on irradiation, mg/100 g
|
Вариант освещения |
Расчеренкованные растения, 74 дня от высадки |
Расчеренкованные растения, 88 дней от высадки |
Взрослые растения |
|
Л1 |
0,316±0,011 |
0,714±0,112 |
2,172±0,18 |
|
Л1+УФ-С |
0,594±0,153 |
1,086±0,153 |
1,635±0,124 |
|
Л2 |
0,251±0,023 |
0,412±0,057 |
1,646±0,213 |
|
Л2+УФ-С |
0,569±0,045 |
1,153±0,253 |
0,667±0,054 |
|
Л3 |
0,52±0,062 |
0,768±0,074 |
1,504±0,341 |
|
Л3+УФ-С |
0,712±0,071 |
1,147±0,215 |
1,539±0,314 |
В таблице 4, на рисунке 5 приведено количественное содержание суммы стевиолгликозидов. Из приведенных данных видно, что в возрасте 74 дня относительное содержание увеличилось при добавлении УФ-С в варианте Л1+УФ-С, а на 88-й день – под Л2+УФ-С и Л3+УФ-С, что говорит о преимущественно положительном действии добавления УФ-С спектра на накопление стевиогликозидов в листьях активно растущих побегов.
Рис. 4. Содержание кверцетина в черенках и взрослых растениях стевии
в зависимости от режима облучения, мг/100 г
The content of quercetin in cuttings and adult stevia plants, depending on irradiation, mg/100 g
Таблица 4
Содержание стевиолгликозидов в черенках и взрослых растениях стевии
в зависимости от облучения, %
The content of steviol glycosides in cuttings and adult stevia plants, depending on irradiation, %
|
Вариант освещения |
74 дня |
88 дней |
Взрослые растения |
|
Л1 |
1,51±0,08 |
1,98±0,10 |
2,23±0,11 |
|
Л1+УФ-С |
1,82±0,09 |
1,76±0,09 |
4,02±0,20 |
|
Л2 |
1,64±0,08 |
1,85±0,09 |
4,32±0,22 |
|
Л2+УФ-С |
1,59±0,08 |
1,99±0,10 |
5,00±0,25 |
|
Л3 |
1,85±0,09 |
1,88±0,09 |
4,02±0,20 |
|
1,82±0,09 |
2,16±0,11 |
4,09±0,20 |
Рис. 5. Содержание стевиолгликозидов в черенках и взрослых растениях стевии
в зависимости от облучения, %
The content of steviol glycosides in cuttings and adult stevia plants, depending on irradiation, %
У взрослых растений минимальное содержание стевиолгликозидов наблюдали в варианте, наиболее близком к солнечному свету (Л1), оно составило 2,23 %. Добавление УФ-С спектра (Л1+УФ-С) увеличивало их количество почти в два раза и довело до 4 %. В варианте Л2+УФ-С по сравнению с Л2 содержание стевиолгликозидов было выше на 15 %. Но в Л3+УФ-С у взрослых растений, так же, как у черенков, на 74-й день разницу между вариантами выявить не удалось.
На сегодняшний день вопрос физиологических функций стевиольных гликозидов остается открытым. Значительные метаболические затраты на синтез стевиолгликозидов ставят под сомнение пользу, которую может получить S. Rebaudiana. Сходство молекулы стевиолгликозида с гиббереллином подтверждается в стимулирующем действии на ряд культур при обработке экстрактами стевии, но эффект зависит от концентрации и окружающих условий среды, в частности, большое значение оказывает освещенность [25].
Повышение накопления стевиолгликозидов при добавлении в спектр УФ-С может усиливать защитные функции стевиолгликозидов в ответной реакции на травмирующее ультрафиолетовое облучение.
Заключение. Добавление к спектру фотосинтетически активной радиации УФ-С излучения повышает накопление кверцетина в активно развивающихся побегах из развивающихся черенков стевии и увеличивает сумму стевиолгликозидов при облучении взрослых растений. Добавленный к ФАР спектр УФ-С может использоваться в качестве экологически чистого фактора увеличения накопления вторичных метаболитов в доуборочной обработке растений стевии.
Благодарность: автор выражает признательность коллегам ФГБНУ ФНАЦ ВИМ, руководителям лабораторий А.А. Смирнову, А.А. Дорохову, А.А. Гришину за разработку и производство камеры с экспериментальными условиями изучения.
