Введение. Ячмень (Hordeum vulgare L.) является одной из ключевых сельскохозяйственных культур, выращиваемых в различных регионах мира на площади 55 млн га. Около 74 % мирового объема производства ячменя обеспечивается десятью странами, в числе которых Российская Федерация (РФ) [1].
Высокий потенциал урожайности ячменя в нашей стране достигается систематической селекционной работой. Несмотря на усилия, экстремальные колебания факторов окружающей среды оказывают заметное влияние на ее результаты. В частности неблагоприятные погодные условия в сочетании с сокращением посевных площадей привели к снижению валового сбора ячменя в РФ с 21,1 млн т в 2023 г. до 16,67 млн т в 2024 г. [2].
Повышение устойчивости растений к абиотическим стрессам представляет собой сложную задачу. В отличие от устойчивости растений к биотическим стрессам, имеющей моногенную природу, генетически сложные ответы на абиотические стрессы являются мультигенными. Устойчивость к абиотическим стрессам является комплексным признаком, формирующимся в результате взаимодействия стрессора с различными молекулярными, биохимическими и физиологическими процессами [3]. В связи с этим ответные реакции растений на абиотические стрессы сложно контролировать и тем более управлять ими.
Эффективным способом повышения генетического разнообразия растений и получения стрессоустойчивых форм является направленная селекция in vitro клеточных (каллусных) культур на селективных питательных средах с последующей регенерацией растений. Использование каллусов в качестве модельных систем для получения устойчивых форм оправдано сходством морфогенетических процессов в растениях в естественных условиях (in planta) и в культивируемых каллусах in vitro [4]. В исследованиях, посвященных оценке регенерантов ячменя, было показано, что технологии in vitro позволяют получать линии, превосходящие исходные сорта по урожайности [5–7]. Однако проблемой остается сохранение стабильности приобретенных хозяйственно-полезных признаков регенерантных генотипов.
Листья верхнего яруса выступают ключевым элементом, определяющим продуктивность сельскохозяйственных культур. Однако данные по зерновым зачастую отличаются. С одной стороны, на примере овса (Avena sativa L.) показано, что генотипы с большими подфлаговыми листьями имеют более крупную метелку с большим числом колосков, зерен и массой зерна, это свидетельствует о положительной связи между морфометрией листьев и урожайностью [8]; с другой стороны, для ячменя установлено, что при оптимальных гидротермических условиях генотипы, обладающие большей площадью флаговых и подфлаговых листьев, затеняют друг друга и конкурируют, это снижает их урожайность [9].
Изменения физиологических, морфологических и анатомических признаков листьев также являются частью общей стратегии адаптации растений к экстремальным факторам окружающей среды. В частности, уменьшение площади листьев при действии различных стрессоров (засуха, повышенные температуры, тяжелые металлы) позволяет снизить потери воды, уменьшить токсическое воздействие ионов металлов и таким образом сохранить жизненно важные функции [10, 11].
Цель исследования – оценка изменений морфометрических и биохимических параметров листьев регенерантных и исходного генотипов ячменя при действии почвенных стрессоров.
Объекты и методы. Исследования проводили в 2024 г. на базе ФГБНУ «Федеральный аграрный научный центр Северо-Востока им. Н.В. Рудницкого» (ФАНЦ Северо-Востока) (Киров, Россия). Объектом исследования служили исходный сорт ярового ячменя Боярин селекции ФАНЦ Северо-Востока (включен в Госреестр по Волго-Вятскому региону, среднеранний, устойчивый к полеганию и засухе) и его регенерантные формы во втором поколении, индуцированные в каллусной культуре на среде Мурасиге–Скуга (МС) с селективными агентами (табл. 1).
Таблица 1
Характеристика генотипов ячменя
Characteristics of barley genotypes
|
Сорт, генотип |
Форма генотипа |
Условия получения |
|
|
Боярин |
Исходный сорт |
Внутривидовая ступенчатая гибридизация |
|
|
RA-Сd |
Регенерантная линия |
Регенерация в каллусной культуре in vitro на селективной среде МС |
15 мг/дм3 Cd2+, рН = 4,5 |
|
RA-Al |
40 мг/дм3 Al3+, рН = 4,0 |
||
|
RA-ПЭГ |
15 % ПЭГ, рН = 5,6 |
||
Семена каждого генотипа в количестве 35 шт. засевали рядками в вегетационные емкости размером 1,5 × 1,3 × 0,3 м. Площадь питания растений составляла 4 × 15 см. Для опыта использовали типичную для Кировской области почву (дерново-подзолистая суглинистая, содержание гумуса – 1,2–2,0 % (ГОСТ 26213-2021), подвижного фосфора – 51,6–82,2 мг/кг, нитратного азота – 2,3–2,8 мг/г по (ГОСТ Р 54650-2011). Моделировали четыре почвенных фона (табл. 2).
Таблица 2
Схема опытов
Scheme of experiments
|
Стрессор |
Почвенный фон |
|||
|
Контрольный |
С кадмием |
Кислый |
Засуха |
|
|
Сd (подвижная форма), мг/кг |
0,036±0,004 |
19,2±0,5 |
0,706±0,018 |
0,036±0,004 |
|
рН солевой вытяжки из почв |
6,8±0,1 |
4,6±0,1 |
4,6±0,1 |
6,8±0,1 |
|
Атмосферные осадки |
Без изоляции |
Изоляция |
||
В качестве модельного токсиканта при загрязнении почвы кадмием использовали дигидрат ацетата кадмия(II) Cd(CH3COO)2 ∙ 2H2O. Уровень содержания подвижных соединений кадмия, внесенных искусственным образом, в почве кадмиевого фона составил 19 ОДК (СанПиН 1.2.3685-21). Исходное содержание кадмия в почве кислого фона составляло 0,706 мг/кг, что значительно превышало (в 20 раз) показатели контрольной почвы и почвы, испытывающей засуху, но не достигало значений ОДК согласно действующим санитарным нормам. Разный уровень содержания кадмия в почвах этих вариантов был обусловлен разным уровнем кислотности (рН 4,6 и 6,8), что влияло на подвижность соединений кадмия в этих условиях. Кратковременная засуха обеспечивалась пленочным покрытием вегетационной емкости в межфазный период развития растений «выход в трубку – начало колошения».
Выращивание растений осуществляли в естественных условиях. В период длительного отсутствия атмосферных осадков осуществляли полив растений водопроводной водой. Исключение составлял засушливый фон в сроки моделирования засухи.
На стадии колошения с 20 случайных растений ячменя срезали подфлаговый лист для исследования параметров роста (длина, площадь), определения содержания фотосинтетических пигментов (хлорофилл a, хлорофилл b, каротиноиды) и фенольных соединений (ФС).
Измерение длины и площади листьев проводили автоматизированным способом по фотоснимкам с помощью программы Image J. Определение содержания антиоксидантов осуществляли спектрофотометрическим методом. Для извлечения пигментов из листьев использовали 100 %-й ацетон [12]. Свободные ФС экстрагировали 70 %-м этиловым спиртом при температуре 5 °С в течение 16 ч, общие (сумма) ФС, в том числе связанные с клеточной стенкой, – раствором гидроксида натрия (2 н.) при температуре 80 °С в течение 2 ч. Содержание ФС было стандартизовано по галловой кислоте [13].
Реакции различных генотипов на почвенные условия были проанализированы с помощью дисперсионного анализа. Данные представляли в виде средних значений ± стандартное отклонение. Разные буквы в таблице 3 указывают на значительную разницу при р < 0,05 по критерию LSD (наименьшее значимое различие). Взаимосвязи между признаками выявляли с помощью корреляционного анализа, доступного в MS Excel.
Результаты и их обсуждение. В ходе исследования было установлено, что генотип (F-Ratio 7,3–7,8) оказывал наибольшее по сравнению с почвенным фоном (F-Ratio 2,8) влияние на морфометрические характеристики подфлагового листа (см. табл. 3).
Среди исследованных стрессоров засуха в большей степени ограничивала рост листьев. Снижение длины листа при засухе составило 8 % по сравнению с кислым фоном, длины и площади – 8 и 16 % по сравнению с кадмиевым фоном. Однако различия с контролем не были статистически достоверными, что указывало на отсутствие выраженного угнетающего действия заявленных абиотических факторов, в том числе кадмия, на рост листьев. Аналогичные результаты были описаны в работе Vassilev et al. [14], которые исследовали физиологическую реакцию ячменя на загрязнение почвы кадмием в концентрации 45 мг/кг. Визуальные признаки фитотоксичности в этом случае наблюдали только на уровне корневой системы, они связаны с большим (в 10 раз), чем в надземной массе, накоплением токсиканта в растительной ткани.
В наших исследованиях, независимо от почвенного фона, наибольшей длиной листа характеризовался исходный сорт. Регенеранты по данному показателю уступали исходному сорту. По площади от исходного сорта отличался только один регенерант – RA-ПЭГ. Для него фиксировали самые низкие значения исследуемого параметра, в том числе за счет наличия скрученности листьев. Следует отметить, что скрученность листьев у ячменя чаще всего рассматривается как симптом нехватки воды и ассоциируется с адаптацией к дефициту влаги [15]. В представленной работе скрученность листьев у RA-ПЭГ наблюдали на всех почвенных фонах, что свидетельствовало о стабильности данного признака в процессе целенаправленного отбора in vitro на селективной среде с осмотиком (ПЭГ 6000). В литературе аналогичные признаки были описаны при отборе перспективных генотипов риса (Oryza sativa L.) [16].
Площадь листьев характеризовалась более высоким коэффициентом вариации (Cv) – 27,8– 42,2 %, чем длина (16,9–24,1 %). При этом максимальная ее вариабельность зафиксирована на почвенном фоне с кадмием (Cv = 42,2 %). Наибольшая изменчивость данного показателя была присуща регенеранту RA-ПЭГ (Cv = 36,6 %).
|
17 |
Изменчивость параметров подфлагового листа ячменя в зависимости от почвенного фона и генотипа
Variability of barley subflag leaf parameters depending on soil light and genotype
|
Градации фактора |
Морфометрические |
Биохимические |
|||||||||||||
|
Длина |
Площадь |
Пигменты |
Фенольные соединения |
||||||||||||
|
Хлорофилл а |
Хлорофилл b |
Каротиноиды |
Свободные |
Сумма |
|||||||||||
|
|
Сv, % |
|
Сv, % |
|
Сv, % |
|
Сv, % |
|
Сv, % |
|
Сv, % |
|
Сv, % |
||
|
Фактор А (почвенный фон) |
|||||||||||||||
|
Контроль |
10,6ab |
19,1 |
4,8ab |
31,7 |
2,9a |
30,7 |
1,2a |
36,5 |
0,8a |
26,6 |
4,9b |
9,2 |
14,9b |
9,9 |
|
|
С кадмием |
11,3b |
24,1 |
5,2b |
42,2 |
2,9a |
42,3 |
1,8b |
43,3 |
0,7a |
28,9 |
4,5a |
7,7 |
14,9b |
8,1 |
|
|
Кислый |
11,3b |
20,1 |
4,8ab |
31,2 |
3,7a |
30,9 |
1,5ab |
32,1 |
0,7a |
25,7 |
4,5a |
9,5 |
14,0ab |
7,7 |
|
|
Засуха |
10,5a |
16,9 |
4,5a |
27,8 |
3,3a |
31,3 |
1,3ab |
36,0 |
0,8a |
27,4 |
4,4a |
10,5 |
13,1a |
10,7 |
|
|
F-Ratiо |
2,8* |
нз |
22,6* |
43,9* |
6,1* |
3,9* |
6,9* |
||||||||
|
Фактор Б (генотип) |
|||||||||||||||
|
Исходный сорт |
11,9b |
19,8 |
5,2b |
32,2 |
2,2a |
15,2 |
0,9a |
15,9 |
0,5a |
21,7 |
4,5a |
9,7 |
12,9a |
9,8 |
|
|
RA-Сd |
10,6a |
19,8 |
4,9b |
32,5 |
3,2b |
42,4 |
1,9c |
32,6 |
0,7b |
28,7 |
4,4a |
8,0 |
14,4b |
9,6 |
|
|
RA-Al |
10,8a |
19,8 |
5,1b |
31,3 |
3,7b |
27,2 |
1,5b |
32,2 |
0,8bc |
10,4 |
4,3a |
8,7 |
14,7b |
9,2 |
|
|
RA-ПЭГ |
10,3a |
19,7 |
4,0a |
36,6 |
3,8b |
20,1 |
1,5b |
21,1 |
0,9c |
9,6 |
4,9b |
9,3 |
14,8b |
8,1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
F-Ratio |
7,3* |
7,84* |
81,9* |
157,6* |
95,4* |
6,2* |
6,9* |
||||||||
|
Взаимосвязь факторов (А×Б) |
|||||||||||||||
|
F-Ratio |
нз |
нз |
47,4* |
41,5* |
17,3* |
нз |
нз |
||||||||
Примечание: * – средние значения статистически различаются при P = 0,05; нз – средние значения статистически не различаются при P = 0,05.
Согласно данным литературы, сокращение площади листа при засухе часто связано с уменьшением удлинения размера его эпидермальных клеток [17]. При низком давлении тургора осмотически обусловленное расширение клеток становится ограниченным, что в итоге приводит к снижению урожайности [15]. Уменьшение листовой площади более характерно для засухоустойчивых сортов [18]. В представленной работе в условиях засухи ячмень не развивал значительно большую площадь подфлагового листа, что, возможно, также связано со снижением эвапотранспирации [11], но в дальнейшем позволило сохранить продуктивность.
В наших исследованиях длина подфлагового листа положительно коррелировала с продуктивностью (r = 0,49) только на кислом фоне, в то время как на почвенном фоне с кадмием и при засухе наблюдалась отрицательная корреляция между продуктивностью и площадью листа (r = –0,48 и r = –0,75 соответственно) (табл. 4).
Таблица 4
Корреляционные связи продуктивности
с морфометрическими параметрами оценки подфлагового листа
Correlation links between productivity and morphometric parameters of subflag leaf assessment
|
Параметр листа |
Почвенный фон |
|||
|
Контрольный |
С кадмием |
Кислый |
Засуха |
|
|
Длина |
–0,26 |
0,03 |
0,49 |
–0,17 |
|
Площадь |
–0,03 |
–0,48 |
0,12 |
–0,75 |
|
|
Генотип |
|||
|
Исходный сорт |
RA-Сd |
RA-Al |
RA-ПЭГ |
|
|
Длина |
0,77 |
0,16 |
–0,39 |
0,99 |
|
Площадь |
0,75 |
0,19 |
–0,87 |
0,82 |
У исходного сорта (r 0,77–0,75) и регенеранта RA-ПЭГ (r 0,99–0,82) изменение длины и площади листьев было более мобильным параметром, тесно связанным с продуктивностью. При изменении условий роста продуктивность регенерантов RA-Сd в меньшей степени определялась морфометрическими характеристиками. RA-Al демонстрировал обратную связь площади листа и продуктивности.
Следующим этапом работы явилась оценка содержания пигментов в листьях. Использование данного показателя в качестве критерия отбора стрессоустойчивых сортов было связано с тем, что фотосинтетические пигменты, наряду с участием в процессе фотосинтеза, выполняют роль антиоксидантов [19, 20]. Результаты исследования выявили значительное влияние на данный параметр оценки как генотипа (F-Ratio 6,2–157,6), так и почвенного фона (F-Ratio 6,2–43,9). В отличие от длины и площади листа, влияние генотипа на содержание фотосинтетических пигментов, существенно определялось условиями его роста (F-Ratio 17,3…47,4). Однако не все пигменты были чувствительны к абиотическим стрессорам. Так, содержание хлорофилла а и каротиноидов в листьях на различных почвенных фонах статистически не различалось, что согласовывалось с результатами сохранения продуктивности генотипов при засухе: снижение длины и площади листьев компенсировалось накоплением пигментов на уровне значений, характерных для нестрессированных растений. Одним из объяснений выявленного эффекта может быть увеличение удельной эффективности фотосинтеза в листьях при засухе [21].
Содержание хлорофилла b изменялось в зависимости от условий почвенной среды. Так, загрязнение почвы кадмием сопровождалось увеличением данного показателя на 50 % по сравнению с контролем. Для этого же почвенного фона регистрировали самую высокую среди исследованных абиотических стрессов вариабельность содержания пигментов (СV 28,9–43,3 %). Согласно данным научной литературы, растения ячменя могут справляться с низкоуровневым стрессом, вызванным кадмием [22]. Кадмий, как показано на примере различных растений, может оказывать неоднозначное влияние на фотосинтез в зависимости от его концентрации [23]. В низких (5–20 мг/кг) он может стимулировать фотосинтетические процессы, тогда как при высоких концентрациях (50–100 мг/кг) его воздействие становится ингибирующим [24]. Различия в ответных реакциях также можно связать с разной чувствительностью фотосинтетических пигментов к кадмию. Например, в гидропонной культуре декоративных растений показано, что уровень хлорофилла a достоверно снижается только при уровне кадмия в среде 100 мг, в то время как содержание хлорофилла b статистически не отличается от контроля при уровне 10–100 мг [25].
Независимо от почвенных условий, исходный сорт имел более низкое по сравнению с регенерантами содержание фотосинтетических пигментов в подфлаговом листе. Различие между этими генотипами в содержании хлорофилла a составило 45–73 %; хлорофилла b – 67–110 %; каротиноидов – 40–80 %. Среди исследованных генотипов наибольшая изменчивость в содержании пигментов в подфлаговом листе отмечена у RA-Cd, что, вероятно, указывает на наличие у данного генотипа адаптационных механизмов, связанных с фотосинтезом.
Важное значение в повышении адаптационного потенциала растений имеет фенольный синтез. Помимо различных физиологических функций в растениях, ФС способны удалять избыток активных форм кислорода, что позволяет растениям справляться со стрессорами [26]. Ответная реакция на стресс может обеспечиваться как связанными с гликозидами ФС, потенциально участвующими в процессах лигнификации, так и их свободной фракцией [27]. Общее содержание ФС, в отличие от фотосинтетических пигментов, в равной степени определялось как генотипом, так и почвенными условиями, что подтверждалось равными значениями F-Ratio (6,9). К числу стрессоров, в наибольшей степени ограничивающих накопление ФС в подфлаговом листе, относилась засуха. Разница с контролем составила 14 %. Также при засухе отмечали наибольшую неоднородность генотипов по общему содержанию ФС в листьях (СV = 10,7 %). Учитывая, что ФС клеточной стенки делают ее менее эластичной, более плотной и жесткой [28], снижение общего содержания ФС в подфлаговом листе при засухе указывало на большую предрасположенность генотипов к скручиванию листьев как одному из способов выживания растений в данных условиях.
Наименьшим суммарным содержанием ФС в листьях характеризовался исходный сорт. Его разница с регенерантами по данному параметру составила от 12 до 15 %. Согласно данным литературы, более высокий уровень накопления ФС является признаком большей адаптированности генотипов к стрессовым условиям [29]. В связи с этим регенеранты по сравнению с исходным генотипом следует считать более устойчивыми к стрессовым факторам.
В отличие от суммы, содержание свободной фракции ФС в листьях ячменя в большей степени определялось генотипом. Наибольшим содержанием ФС характеризовался RA-ПЭГ. Разница с исходным генотипом и прочими регенерантами по свободной фракции ФС составила 12–19 %. Усредненные значения содержания свободных ФС в листьях на контрольном фоне были выше, чем в условиях абиотических стрессов, на 9–10 % и противопоставлялись данным по общему содержанию ФС, что частично затруднило их интерпретацию. Одна из причин ее возникновения обусловлена неуточненностью химической структуры ФС при их определении [30].
Заключение. Таким образом, установлено сложное взаимодействие генотипических и средовых факторов, которые оказывают влияние на морфологические и биохимические показатели листьев ячменя. Исходный сорт в большинстве случаев превосходил регенеранты по длине и площади листа, независимо от почвенного фона, однако при отрицательной корреляции с продуктивностью. На почвенных стрессовых фонах регенеранты обладали более высоким антиоксидантным потенциалом, диагностируемым по содержанию фотосинтетических пигментов и ФС в листьях, что привело к повышению продуктивности регенерантных генотипов в этих условиях по сравнению с исходной формой. Среди исследуемых генотипов выделялся регенерант RA-ПЭГ, характеризующийся в условиях засухи большим преимуществом по исследуемым параметрам. Снижение площади листа у RA-ПЭГ расценивали как проявление адаптационного механизма.
