Россия
Россия
докторант с 01.01.1993 по 01.01.1998
Казан, Республика Татарстан, Россия
Цель исследования – определить особенности воздействия селимакцида на ультраструктуру бактериальных клеток с помощью анализа морфометрических показателей и выявить релевантные количественные характеристики воздействия этого антимикробного препарата. Задачи: рассчитать морфометрические характеристики как нативных бактерий, так и подвергавшихся воздействию селимакцида; провести статистическую обработку полученных данных; сделать выводы о значимости различных переменных для оценки влияния селимакцида на ультраструктуры бактерий и о факте наличия подобного влияния. Объект исследования – изоляты энтеропатогенных бактерий Salmonella enteritidis и Escherichia coli. Для оценки бактерицидной эффективности селимакцида данный препарат применяли в концентрации 20 мг/мл. Электронно-микроскопические исследования по методу ультратонких срезов выполнялись на трансмиссионном электронном микроскопе JEM 100 CX-II. Морфометрические показатели (площади бакте¬риальных клеток и их цитоплазмы) на электронограммах рассчитывали посредством программы FIJI – ImageJ. Статистические гипотезы проверяли с использованием непараметрического теста Манна – Уитни с поправкой на множественные сравнения по методу Бенджамини – Хохберга, критический уровень значимости при интерпретации результатов теста составлял α = 0,05. Бактериальные клетки обоих изолятов после воздействия селимакцида не изменяли своих размеров, различия между контрольными и экспериментальными группами были статистически не значимыми (p = 0,15 для S. enteritidis и p = 0,71 для E. coli). Эффект селимакцида на субмикроскопическом уровне проявлялся увеличением периплазматического пространства и уплотнением цитоплазмы вокруг просветленного нуклеоида, что сопровождалось уменьшением соотношения площади цитоплазмы и всей клетки: у S. enteritidis – на 7,5 %, у E. coli – на 6,8 %. Периплазматическое пространство увеличивалось: у S. Еnteritidis на – 67,9 %, у E. coli – на 166,7 %. Результаты свидетельствуют о действии селимакцида на упаковку или даже фрагментацию генетического материала, белоксинтезирующего комплекса и ионно-транспортной системы в бактериальных клетках S. enteritidis и E. coli.
морфометрия, ультраструктура, селимакцид, энтеробактерии, клеточная стенка, цитоплазма, периплазматическое пространство, нуклеоид
Введение. Исследования особенностей ультраструктуры Salmonella enteritidis и Escherichia coli имеют многолетнюю историю [1, 2]. Ученые изучали как нативное состояние энтеробактерий [3], так и влияние на них различных бактерицидных средств [4–6]. В научной литературе имеются сообщения о проявлении бактерицидной активности препарата селимакцид при желудочно-кишечных и респираторных заболеваниях [7, 8].
Поскольку электронная микроскопия позволяет визуализировать внутриклеточные структуры бактериальных клеток, на первом этапе была проведена общая оценка влияния селимакцида на субмикроскопическую организацию сальмонелл и эшерихий; следующим этапом являлась количественная проверка выявленных качественных характеристик процесса [9].
Цель исследования – определить особенности воздействия селимакцида на ультраструктуру бактериальных клеток с помощью анализа морфометрических показателей и выявить релевантные количественные характеристики воздействия этого антимикробного препарата.
Задачи: рассчитать морфометрические характеристики как нативных бактерий, так и подвергавшихся воздействию селимакцида; провести статистическую обработку полученных данных; сделать выводы о значимости различных переменных для оценки влияния селимакцида на ультраструктуры бактерий и факте наличия подобного влияния.
Материал и методы. Энтеропатогенные штаммы чистых культур Salmonella enteritidis и Escherichia coli термостатировали при температуре 37 °С в течение 24 ч на мясопептонном агаре. Через 1 сут бактериальные культуры суспензировали посредством изотонического раствора с целью достижения концентрации 2 миллиарда микробных клеток в 1 мл. Необходимую бактериальную концентрацию формировали, сравнивая по стандарту мутности бактериальных взвесей (комплект БАК) СОП № 1-98-15. Оба осадка культур, полученные при центрифугированиях с экспозициями по 15 мин (5000 об/мин), по одному разу промывали, используя физиологический раствор. С целью оценки антибактериального эффекта селимакцида в суспензии исходных штаммов вносили жидкую форму данного препарата в концентрации 20 мг/мл и через полчаса проводили центрифугирование, оба осадка промывали посредством изотонического раствора NaCl.
Электронно-микроскопические исследования выполнялись по отработанному нами методу получения ультратонких срезов [10]. Протокол подготовки образцов к исследованию представлен в таблице 1.
Для расчета морфометрических показателей (площади бактериальных клеток и их цитоплазмы) на микрофотографиях использовали программу FIJI–ImageJ [11]. Анализ результатов морфометрической обработки снимков проводили в программе Statistica 6.0 с использованием методов описательной и непараметрической статистики. Были вычислены такие показатели, как арифметическое среднее значение (M), его стандартное отклонение (Sd), а также минимальные и максимальные значения признаков. Для проверки статистических гипотез использовали непараметрический тест Манна – Уитни с поправкой на множественные сравнения по методу Бенджамини – Хохберга; результаты теста интерпретировали исходя из критического уровня значимости α = 0,05.
Таблица 1
Основные этапы подготовки материала для ультраструктурных исследований
|
Этап |
Компонент |
|
1 |
2 |
|
Фиксация |
1 % раствор глутарового альдегида (Serva, ФРГ) на 0,1 М фосфатном буфере (рН = 7,4), при t = 4 °С, 12 ч |
|
Промывка буфером |
0,1 М фосфатным буфером (рН = 7,4) 2 раза по 10 мин |
|
Фиксация |
2 % тетраоксид осмия OSO4 (Московский химзавод) на 0,1 М фосфатном буфере (рН = 7,4), при комнатной температуре, 2 ч |
|
Промывка буфером |
0,1 М фосфатным буфером (рН = 7,4) 2 раза по 10 мин |
Окончание табл. 1
|
1 |
2 |
|
Дегидратация |
Этиловые спирты восходящей концентрации – 30, 50, 70, 80, 96 % – 2 раза по 5 мин; абсолютные спирты 100 (I), 100 (II), 100 (III) – 2 раза по 10 мин каждый; ацетон – 2 раза по 10 мин |
|
Пропитка заливочной средой |
Ацетон + эпоновые смолы: • смесь ацетон – смола (в частях 2:1) – 6 ч; • смесь ацетон – смола (в частях 1:1) – 12 ч; • смесь ацетон – смола (в частях 1:2) – 12 ч |
|
Заливка в капсулы |
Эпоновые смолы |
|
Полимеризация |
В термостате при t = 30 °С, t = 45 °С и t = 60 °С по 24 ч |
|
Полутонкая резка |
Микротом LKB-III 8800 (Швеция) |
|
Ультратонкая резка |
Микротом Reichert-Jung Ultracut-E 6524-01 (Австрия) |
|
Контрастирование сеточек |
Уранилацетат 2 % водный 2 ч при 37 °С, цитрат свинца 1,5 мин в присутствии щелочи |
|
Просмотр срезов и съемка на фотопленку |
Электронный микроскоп JEM 100 CX-II (Jeol, Japan); фототехническая пленка Agfa orthochromatic |
|
Оцифровка снимков |
Сканер Epson perfection 4990 foto с разрешением 600 dpi |
Результаты и их обсуждение. Бактериальные клетки – Salmonella enteritidis и Escherichia coli на ультратонких срезах округлой или палочковидной формы. Электронограммы грамотрицательных бактериальных клеток четко демонстрируют извилистую многослойную клеточную стенку, периплазматическое пространство и цитоплазматическую мембрану (рис. 1–4). Ультраструктура цитоплазмы нативных бактерий характеризуется высокой электронной плотностью с заполнением гранулярным компонентом – рибосомами, полирибосомами (см. рис. 1, 3). Область нуклеоида не всегда визуализируется. Нити ДНК распределены по цитоплазме.
Воздействие селимакцида не изменяет размеры бактериальных клеток Salmonella enteritidis и Escherichia coli, так, различия между группами контроля и опыта статистически не значимы (p = 0,15 для S. enteritidis и p = 0,71 для E. coli). При этом у обеих исследуемых культур по периферии цитоплазмы наблюдалось уплотнение мелкогранулярного компонента цитоплазмы, а также просветление в центральной части клетки в области нуклеоида. Четко визуализируется расширение периплазматического пространства, чаще с дистальных сторон клеток, которое заполняется мелкогранулярным хлопьевидным содержимым средней электронной плотности (см. рис. 2, 4).
Для подтверждения наиболее выраженных визуальных признаков провели измерения общей площади бактериальных клеток (Sк) и их цитоплазмы (Sц), Sк/Sц – соотношение между площадью клеток и площадью их цитоплазмы (рис. 5).
Площадь клеток Salmonella еnteritidis уменьшилась под воздействием селимакцида на 15,4 %, а также на 22,2 % уменьшилась площадь цитоплазмы, что, вероятно, связано с нарушениями упаковки генетического материала и, соответственно, работы белоксинтезирующего комплекса. У Escherichia coli под воздействием селимакцида площадь клеток уменьшилась всего на 6,1 % при уменьшении площади цитоплазмы на 13,4 %. Тем не менее данные отличия статистически не значимы и могут быть отмечены лишь в качестве тенденции.
Увеличение периплазматического пространства и уплотнение цитоплазмы вокруг просветленного нуклеоида проявляются уменьшением соотношения площади цитоплазмы и всей клетки – на 7,5 % у S. enteritidis и на 6,8 % у E. coli. Данные различия статистически значимы; тем не менее в случае с E. coli данный эффект теряет статистическую значимость после введения поправки на множественные сравнения (что может быть связано с относительно небольшой величиной исследованной выборки и может быть в дальнейшем проверено на более обширном материале). Расширение периплазматического пространства клеток определяется как разность между общей площадью бактериальной клетки и площадью цитоплазмы (оно увеличивается на 67,9 % у S. enteritidis и на 166,7 % у E. coli). Изменения периплазматического пространства клеточного барьера микроорганизмов, вероятно, связано с нарушениями структуры транспортных систем.
|
|
|
|
Рис. 1. Фрагмент среза нативной культуры Salmonella enteritidis: КС – клеточная стенка; ЦП – цитоплазма; В – включения цитоплазмы; Г – гранулы на поверхности |
Рис. 2. Фрагмент среза культуры Salmonella enteritidis после воздействия селимакцида: КС – клеточная стенка; ЦП – цитоплазма; ПП – периплазматическое пространство; Н – нуклеоид |
|
|
|
|
Рис. 3. Фрагмент среза нативной культуры Escherichia coli: КС – клеточная стенка; ЦП – цитоплазма |
Рис. 4. Фрагмент среза культуры Escherichia coli после воздействия селимакцида: КС – клеточная стенка; ЦП – цитоплазма; ПП – периплазматическое пространство; Н – нуклеоид |
Рис. 5. Морфометрические показатели бактериальных клеток Salmonella enteritidis
и Escherichia coli контрольной и опытной групп: Sк – общая площадь клетки, μм2; Sц – площадь
цитоплазмы, μм2; Sк/Sц – соотношение между площадью клетки и площадью цитоплазмы;
наличие статистически значимых отличий от группы контроля (p ≤ 0,05): a – без поправки
на множественные сравнения; b – с поправкой на множественные сравнения
Полученные данные свидетельствуют о наличии деструктурирующего воздействия селимакцида на бактериальные клетки Salmonella enteritidis и Escherichia coli.
Результаты данного исследования по особенности ультраструктурной организации бактериальных клеток на фоне влияния селимакцида в целом по внешним признакам согласуются с данными других авторов.
Так, при воздействии ионов серебра на рост кишечной палочки [12] ультраструктура бактерий характеризовалась отделением клеточной стенки от клеточной мембраны. Авторы предполагают, что антибактериальный эффект приводит к нетипичному проявлению жизнедеятельности у E. coli, когда бактерии проявляют признаки физиологической активности, но у них прекращается рост (становятся некультивируемыми в средах).
В работе [13] экстракты растений Syzygium legatii и Eugenia zeyheri вызывали ультраструктурные повреждения клеток E. coli, характеризующиеся результатами (изменениями внешней и внутренней морфологии), внешне схожими с нашими: после трехчасового воздействия экстрактов S. legatii и E. zeyheri в дозе 0,04 мг/мл у сальмонелл отмечалось отделение клеточной стенки от мембраны и просветление цитоплазмы.
Клетки Escherichia coli, подвергшиеся воздействию антибиотика полимиксина В, имели набухшую оболочку с трубчатыми фимбриями и фимбриями, похожими на лучистые придатки [14]. Цитоплазма имела пониженную электронную плотность и была почти электронно-прозрачной. В группе, подвергшейся воздействию полимиксина В и миконазола, плазматическая мембрана отделялась от клеточной стенки. По мнению авторов, антибиотики изменяют проницаемость мембран и внутриклеточную рН.
В недавнем эксперименте [15] по оценке влияния гипохлорита натрия на ультраструктуру Salmonella enteritidis также показаны характерные смещения цитоплазматического содержимого, вплоть до разрывов клеточных стенок.
Заключение. Проведенное исследование воздействия селимакцида на ультраструктурную организацию Salmonella enteritidis и Escherichia coli показало, что наиболее релевантными признаками являются уменьшение объема цитоплазмы клеток (что выражается в уменьшении соотношения площадей цитоплазмы и всей клетки – на 7,5 % у S. enteritidis и на 6,8 % у E. coli); расширение периплазматического пространства, особенно на дистальных участках клеток, заполненного хлопьевидным веществом средней электронной плотности (на 67,9 % у S. enteritidis и на 166,7 % у E. coli).
По результатам исследования можно предположить, что селимакцид оказывает действие на упаковку или даже фрагментацию генетического материала, белоксинтезирующий комплекс и ионно-транспортные системы барьера клетки.
1. Cedergren B., Holme T. On the glycogen in Escherichia coli B; electron microscopy of ultrathin sections of cells // Journal of Ultrastructure Research. 1959. Vol. 3. (1). P. 70–73.
2. Takeuchi A. Electron microscope studies of experimental salmonella infection. I. Penetration into the intestinal epithelium by Salmonella typhimurium // Am J Pathol. 1967. Vol. 50 (1): P. 109–136.
3. A structural study of Escherichia coli cells using an in situ liquid chamber TEM technology / Y. Wang [et al.] // Journal of Analytical Methods in Chemistry. 2015. DOI:https://doi.org/10.1155/2015/ 829302.
4. Чугунова Е.О. Разработка ускоренного способа определения сальмонелл в мясе и мясных продуктах: автореф. дис. … д-ра биол. наук: 06.02.05. Пермь, 2017. 37 с.
5. Singh A.P., Prabha V., Rishi P. Value addition in the efficacy of conventional antibiotics by Nisin against Salmonella // Plos. 2013. DOI: 10.1371/ journal.pone.0076844.
6. Effect of essential oils on the inhibition of biofilm and quorum sensing in Salmonella enteritidis 13076 and Salmonella typhimurium 14028 / Y. Guillin [et al.] // Antibiotics. 2021. Vol. 10. № 10. DOI:https://doi.org/10.3390/antibiotics 10101191.
7. Потехина Р.М., Макаев Х.Н., Муртазина Г.Х. Антимикробная активность, токсикологические параметры и возможные отдаленные последствия селимакцида // Ветеринарный врач. 2009. № 5. С. 6–9.
8. Потехина Р.М. Фармако-токсикологическое обоснование применения селимакцида при желудочно-кишечных болезнях: автореф. дис. … канд. биол. наук: 06.02.03. Казань, 2010. 19 с.
9. Муртазина Г.Х., Сальникова М.М. Электронно-микроскопические исследования антибактериального эффекта селимакцида в отношении сальмонелл и эшерихий // Казанский медицинский журнал. 2016. № 1 (97). С. 77–83.
10. Методические рекомендации по электронно-микроскопическим исследованиям биологических объектов / А.В. Иванов [и др.]. М.: Росинформагротех, 2011. 67 с.
11. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis / J. Schindelin [et al.] // Nature methods. 2012. Vol. 9, №. 7. P. 676–682. DOI:https://doi.org/10.1038/nmeth.2019.
12. Antibacterial activity and mechanism of action of the silver ion in Staphylococcus aureus and Escherichia coli / W.K. Jung [et al.] // Applied and Environmental Microbiology. 2008. Vol. 74. No. 7. DOI:https://doi.org/10.1128/AEM.02001-07.
13. The ultrastructural damage caused by Eugenia zeyheri and Syzygium legatii acetone leaf extracts on pathogenic Escherichia coli / I.M. Famuyide [et al.] // BMC Veterinary Research. 2020. Vol. 16, No. 326. DOI: 10.1186/ s12917-020-02547-5.
14. Is transmission electron microscopy (TEM) a promising approach for qualitative and quantitative investigations of polymyxin B and miconazole interactions with cellular and subcellular structures of Staphylococcus pseudin¬termedius, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa and Malassezia pachydermatis? / M. Voget [et al.] // Veterinary Microbiology. 2015. Vol. 181. Issues 3–4, 31. P. 261–270.
15. Chlorine tolerance and cross-resistance to antibiotics in poultry-associated Salmonella isolates in China / X. Xiao [et al.] // Frontiers in Microbiology. 2022. DOI:https://doi.org/10.3389/fmicb.2021. 833743.
