Введение. Мицелиальный гриб Rhizopus stolonifer Vuillemin (1902) (отдел Zygomycota, класс Zygomycetes, порядок Mucorales, семейство Mucoraceae) является одним из наиболее распространенных возбудителей гнилей при хранении плодоовощной продукции. Благодаря формированию столонов, гриб способен к быстрой колонизации субстратов, что делает его одним из наиболее вредоносных возбудителей гнилей хранения [1, 2]. Относительно недавно R. stolonifer стал известен как возбудитель текучей гнили земляники садовой Fragaria × ananassa (Duchesne ex Weston) Duchesne ex Rozier (1785). При этом заболевании плоды земляники поражаются на растениях еще до созревания. На пораженных плодах появляются светлые пятна, цвет которых быстро меняется на бурый, затем плоды размокают, мацерируются, теряют сок и покрываются слоем мицелия и спороносящих структур гриба. Болезнь практически одновременно стала актуальной для всех производящих землянику регионов, при этом потери урожая могут достигать 50–90 % [3]. В 2009 г. данное заболевание впервые зафиксировано в Краснодарском крае, где оно уничтожило до 80 % урожая [4]. Попытки подобрать фунгициды, эффективные против данного заболевания и безопасные с точки зрения потребителя, на сегодняшний момент не увенчались успехом. В этой связи зарубежными исследователями рассматриваются альтернативные методы борьбы с R. stolonifer. Так, в работе [5] продемонстрирована высокая антигрибная активность экстрактов бурой водоросли Laminaria digitata в отношении R. stolonifer. В работе [6] рассмотрена возможность борьбы с данным возбудителем с помощью эфирных масел Eucalyptus staigeriana, Lippia sidoides и Pimenta pseudocaryophyllus.
Известно, что листья брусники содержат вещества, обладающие высокой антибактериальной активностью [7]. Ранее нами была показана высокая эффективность водного экстракта листа брусники в предотвращении микробиологической порчи папоротника-орляка соленого [8, 9]. Настоящее исследование посвящено оценке возможности использования водного экстракта листьев брусники против возбудителя гнили земляники R. stolonifer.
Цель исследования: изучение антигрибной активности водного экстракта листьев брусники в отношении R. stolonifer.
Задачи исследования: проверка наличия антигрибного эффекта водного экстракта листьев брусники в отношении R. Stolonifer; изучение зависимости антигрибной активности от концентрации экстракта; построение регрессионных моделей, описывающих зависимость антигрибного эффекта от концентрации экстракта.
Объекты и методы исследования. В качестве тест-объекта использован штамм R. stolonifer, выделенный из пораженной текучей гнилью земляники садовой на гидропонной установке в Институте агроэкологических технологий ФГБОУ ВО Красноярский ГАУ (рис. 1, 2).
Рис. 1. Спорангии R. stolonifer (ширина линейки 1 мм)
Рис. 2. Споры R. stolonifer (ширина линейки 10 мкм)
Для приготовления водного экстракта использовали лист брусники сухой производства «ФармаЦвет» (13 % влажность). Листья брусники в количестве 135 г/л настаивали в жидкой среде Чапека-Докса в течение 4,5 ч на водяной бане при 50 °С. Дозировка листьев и способ приготовления вытяжки были выбраны на основе предыдущих экспериментов по изучению антимикробных свойств листа брусники в отношении микроорганизмов, вызывающих порчу папоротника-орляка соленого.
Для проверки антигрибных свойств вытяжки листьев брусники использовали тест, основанный на прорастании спор [10]. Полученный настой смешивали с суспензией спор R. stolonifer в жидкой среде Чапека-Докса в соотношении 1:1, после чего готовили серию разведений полученной смеси с использованием той же суспензией спор R. stolonifer. Контролем служила суспензия спор R. stolonifer в жидкой среде Чапека-Докса без добавления вытяжки листьев. Эксперимент проводили в плашках для иммуноферментного анализа, по 20 мкл суспензии в ячейке. После заполнения ячеек плашку инкубировали в течение 12 ч во влажной камере при температуре +24 °С, после чего подсчитывали число проросших и непроросших спор в каждом варианте. Подсчет проросших и непроросших спор проводили по микрофотографиям (рис. 3).
Общее число подсчитанных спор в вариантах составило от 359 до 944 шт. (табл. 1).
Рис. 3. Проросшая (1) и непроросшая (2) споры R. stolonifer
(стрелкой показана проростковая гифа; ширина линейки 10 мкм)
Таблица 1
Схема эксперимента
|
Разведение исходной вытяжки, раз |
Концентрация в пересчете на сухой лист брусники, г/л |
Общее число подсчитанных спор, шт |
|
Контроль |
0 |
585 |
|
2 |
67,500 |
359 |
|
4 |
33,750 |
854 |
|
8 |
16,875 |
647 |
|
16 |
8,438 |
944 |
|
32 |
4,219 |
490 |
|
64 |
2,109 |
682 |
|
128 |
1,055 |
525 |
|
256 |
0,527 |
628 |
Микрофотосъемку выполняли с помощью микроскопа «Микмед-6» вар. 3, оснащенного цифровой камерой DCM-130E.
Статистическую значимость различий по прорастанию спор между вариантами опыта и контролем определяли на основе точного F-теста для таблиц 2 × 2 с использованием пакета StatSoft STATISTICA 6.0. Для множественного сравнения применяли критерий хи-квадрат. Подбор уравнений регрессии и определение коэффициентов в этих уравнениях проводили с помощью модуля User-specified regression (Пользовательская регрессия), входящего в пакет StatSoft STATISTICA 6.0.
Результаты исследования. Водная вытяжка листьев брусники оказала ярко выраженный антигрибной эффект в отношении R. stolonifer. Статистически значимое снижение прорастания спор в сравнении с контролем отмечено даже при разведении исходной вытяжки в 256 раз (табл. 2).
Таблица 2
Влияние разных концентраций водной вытяжки листьев брусники
на прорастание спор R. Stolonifer
|
Разведение исходной вытяжки, раз |
Прорастание, % к контролю |
Значимость различий с контролем p |
|
Контроль |
100,0 |
– |
|
2 |
16,7 |
< 0,001 |
|
4 |
21,5 |
< 0,001 |
|
8 |
16,2 |
< 0,001 |
|
16 |
27,8 |
< 0,001 |
|
32 |
37,5 |
< 0,001 |
|
64 |
40,1 |
< 0,001 |
|
128 |
37,9 |
< 0,001 |
|
256 |
81,2 |
< 0,05 |
В то же время в интервале разведений исходной вытяжки в 2–8 раз доля выживших спор практически не меняется, варьируя в пределах 16,2–21,5 %. Сравнение этих вариантов по критерию хи-квадрат не выявило между ними статистически значимых различий.
Регрессионный анализ показал, что зависимость доли погибших спор R. stolonifer от концентрации вытяжки листьев брусники носит характер кривой с насыщением и адекватно (с коэффициентом детерминации R2 = 0,997) может быть описана суммой двух логистических функций F1 и F2, каждая из которых имеет следующий вид:
,
где Y – доля погибших спор, %; Ymax – максимально возможная доля погибших спор, %;
X – концентрация вытяжки, г/л в пересчете на сухой лист; X0 – концентрация вытяжки, при которой доля погибших спор равна 1/2 от Ymax;
k – коэффициент.
Результаты подбора параметров для функций F1 и F2 представлены в таблице 3.
Таблица 3
Результаты подбора параметров для функций F1 и F2
|
Параметр |
F1 |
F2 |
|
Ymax |
61,04177 |
20,80989 |
|
X0 |
0,539532 |
8,228941 |
|
k |
66,9231 |
0,739612 |
Можно предположить, что указанные функции соответствуют двум разным химическим соединениям с антифунгальной активностью, входящим в состав вытяжки. Первое соединение, которому соответствует функция F1, ответственно за гибель 61 % спор в эксперименте. Второе соединение, которому соответствует функция F2, ответственно за гибель 20,8 % спор. Ниже представлены теоретические кривые для функций F1 и F2, а также кривая для суммы функций F1+F2 (рис. 4–6).
Рис. 4. Теоретическая кривая для функции F1
Рис. 5. Теоретическая кривая для функции F2
Рис. 6. Теоретическая кривая для суммы функций F1+F2
и экспериментальные значения
Следует отметить, что около 17 % спор выживали даже при максимальной испытанной концентрации вытяжки листьев брусники (67,5 г/л в пересчете на сухой лист), причем характер экспериментальной и теоретической зависимости говорит о том, что использовать вытяжку с концентрацией выше 17–20 г/л в пересчете на сухой лист не целесообразно.
Тем не менее, несмотря на отсутствие полного подавления R. stolonifer в нашем эксперименте, эффективность водной вытяжки листа брусники оказалась сопоставимой с эффективностью других природных антигрибных средств, изученных в работах [5] и [6].
Заключение. Изучение влияния водной вытяжки листа брусники на прорастание спор возбудителя гнили земляники R. stolonifer показало, что эта вытяжка оказывает статистически значимое ингибирующее воздействие на данный гриб уже в концентрации 0,53 г/л в пересчете на сухой лист. Максимальный антигрибной эффект достигается при концентрации вытяжки около 17 г/л в пересчете на сухой лист, после чего кривая «доза-эффект» выходит на плато. Регрессионный анализ показал, что наблюдаемая зависимость доли погибших спор от концентрации вытяжки адекватно описывается суммой двух логистических функций, что позволяет предположить наличие в вытяжке двух разных веществ, обладающих антифунгальной активностью в отношении R. stolonifer. Несмотря на ярко выраженный антифунгальный эффект, вытяжка листа брусники не обеспечивает полного подавления R. stolonifer. В этой связи данную вытяжку можно рекомендовать в качестве дополнительного средства борьбы с R. stolonifer в сочетании с другими мерами по защите урожая от данного гриба.
