Введение. В последнее время распространенность целиакии приобретает значительные масштабы. Это одно из немногих наследственных заболеваний, которое значительно снижает качество жизни. Для снижения рецидивов и увеличения длительности ремиссии разработка программ диагностики и назначение безглютеновой диеты крайне актуально [1]. Значимость рационов безглютенового питания с составленными рецептурами необходимо законодательно утвердить, поскольку от этого зависит здоровье и качество жизни больных целиакией [2, 3].
В литературе имеется множество публикаций по модификации глютена, приводящей к снижению его аллергенных свойств [4–6]. Есть сведения по снижению аллергенности до низкомолекулярных пептидов и аминокислот растительными, животными, микробными пептидазами [7–12]. Применение пептидаз из пророщенного зерна, пепсина или трипсина, микробных пептидаз на основе Aspergillus, молочнокислых бактерий имеет возможность получения низкоглютеновых продуктов с содержанием глютена от 20 до 100 мг/кг [13–15].
Грибы рода Aspergillus – чрезвычайно разнообразная и метаболически гибкая группа микромицетов. У семи различных видов рода Aspergillus (A. nidulans, A. niger, A. oryzae, A. terreus, A. flavus, N. fischeri и A. fumigatus) идентифицированы 133 возможные пептидазы [16]. По результатам сравнения геномов в грибах рода Aspergillus составляют гены, кодирующие сериновые пептидазы. Проведенные исследования биокаталитических активностей ферментов подтверждают эти результаты, так как сериновые пептидазы действительно представляют наиболее крупный класс протеолитических ферментов [17, 18].
Среди пептидаз грибного происхождения пептидаза из Aspergillus niger (AN-PEP) очень эффективно разрушает белки и пептиды глютена [16–18]. Представленный фермент оптимально работает при нейтральном рН, остается стабильным при кислом и полностью устойчив к перевариванию пепсином. Он разрушает неповрежденные белки глютена, а также стимулирующие Т-клетки пептиды гораздо быстрее, чем микробные пептидазы на основе бактериальных культур. Еще одним преимуществом является то, что некоторые штаммы рода Aspergillus являются непатогенными, и ферменты на их основе могут быть произведены с невысокими затратами в промышленных условиях. Также известно, что пептидазы из Aspergillus oryzae (в основном дипептидилпептидаза IV) способны детоксифицировать достаточное количество глютена [19, 20].
Но очевидно, что до сих пор существует актуальность разработки новых методик снижения глютеновых фрагментов и получения продуктов на их основе. Одним из эффективных методов является метод биокаталитической деградации глютена [21–23].
Цель исследования – изучение возможностей использования протеиназ грибного происхождения для блокирования механизмов возникновения и развития целиакии путем гидролиза глютеновых белков, являющихся основой развития данного заболевания.
Объекты и методы. В качестве объектов исследований были использованы мука и экструдат пшеницы из цельнозерновой муки. Для проведения гидролиза муки и экструдата были использованы ферментные препараты: КФПА (комплексный ферментный препарат Амилопротооризин) и ферментные препараты, содержащие ферменты амилолитического и протеолитического действия. Уровень протеолитической активности анализировали по степени гидролиза гемоглобина [24], амилолитической и глюкоамилазной – по степени гидролиза крахмала [25], ксиланазной – по степени гидролиза ксилана [26], целлюлазной – по степени гидролиза карбоксиметилцеллюлозы [27]. Cостав и концентрацию свободных аминокислот определяли на высокоэффективном жидкостном хроматографе фирмы KNAUER (Германия) [28].
Процесс гидролиза высокомолекулярных полимеров белковых веществ осуществляли ФП в подобранных ранее условиях: в течение 2 ч при 50 °С, при рН 5,5 [14], гидромодуль суспензии 1:2. Для исследования белковых фракций ферментолизатов и исходного сырья использовали метод ДДС-электрофореза в полиакриламидном геле [29]. Статистическую обработку экспериментальных данных проводили методом однофакторного дисперсионного анализа с помощью компьютерной программы Excel.
Результаты и их обсуждение. Как известно, для гидролиза пшеницы необходимо осуществить подбор ферментов или ферментных систем для максимальной деструкции высокомолекулярных белков до низкомолекулярных пептидов и свободных аминокислот.
На первом этапе исследований изучали состав ферментов, входящих в состав ферментного комплекса.
В таблице 1 в качестве ферментов для гидролиза глютена использовали ферментные препараты протеолитического и амилолитического действия (ФС), включающие ферментные препараты: ФП Flavourzyme, содержащий две аминопептидазы, две дипептидилпептидазы, три эндопептидазы; ФП Neutrase, содержащий нейтральную протеазу; ФП Fyngamyl, содержащий альфа-амилазу производства компании Novozymes. В качестве сравнения с импортными аналогами использовали ферментный препарат отечественного производства КФПА, содержащий в своем составе ферменты аминопептидазу, эндопептидазу, нейтральную протеазу и альфа-амилазу для гидролиза белковых и крахмалистых веществ зернового сырья.
Далее исследовали ФП КФПА и комплекс ферментов Flavourzyme + Neutrase + Fyngamyl на степень гидролиза полимеров белковых веществ. Для этого был проведен электрофорез в ПААГ с маркером от 14,4 до 97,4 кДа. Объектами служили прогидролизованные цельнозерновая пшеничная мука и экструдат,полученный на основе этой муки.
Таблица 1
Характеристика используемых ферментных препаратов
|
Ферментный препарат |
Продуцент |
Состав ферментного комплекса,ед/г (ед/см3) |
||||
|
ПС |
АС |
ГлС |
КС |
ЦС |
||
|
КФПА (комплексный ферментный препарат Амилопротооризин) |
Aspergillus oryzae |
600+29,5 |
800+39,5 |
0 |
50+2,3 |
0 |
|
Протоферм FP |
Aspergillus niger |
900+43,0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
Flavourzyme |
Aspergillus oryzae |
500+22,8 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
Брюзайм |
Aspergillus niger |
0 |
0 |
0 |
1000+48,5 |
1100+52,3 |
|
Термамил |
Bacillus subtiliis |
0 |
900+45,0 |
200+10,5 |
0 |
0 |
|
кДа
97,4 75,0 50,0
37,0 31,0 20,0
14,4
|
ДДС-электрофорез исследуемых гидролизатов:
М – маркер; 1 – мука пшеничная (контроль); 2 – экструдат муки (контроль);
3 – мука пшеничная + КФПА; 4 – экструдат муки + КФПА
5 – мука пшеничная + ФС; 6 – экструдат муки + ФС
На ДДС-электрофореграмме показана возможность применения ферментов для гидролиза муки и экструдата (см. рис.). Результаты подтверждают, что использование ФП КФПА и ФС, содержащей протеазу, эндопептидазу и альфа-амилазу, эффективно для гидролиза аллергенных высокомолекулярных белков.
Аминокислотный состав белков пшеницы (глиадина и глютена) придает определенные свойства ферментолизату на основе данного вида сырья. По литературным данным известно, что ферментный гидролиз «разрывает» связи между аминокислотами так, что в конце аминокислотной цепочки остается глутаминовая кислота.
Кроме глутаминовой кислоты белок клейковины пшеницы содержит в большем количестве пролин, серин и глицин. Результаты электрофореза демонстративно свидетельствуют о снижении в процессе гидролиза молекулярной массы белков, что говорит о наличии в составе ферментолизатов аминокислот и низкомолекулярных пептидов.
Поэтому полученные ферментолизаты пшеницы исследовали на состав свободных аминокислот (табл. 2).
Таблица 2
Состав свободных аминокислот гидролизатов пшеницы
|
Аминокислота, г/100 г образца |
Образец 1 (пшеница без ФП) |
Образец 2 (гидролизат с КФПА) |
Образец 3 (гидролизат с ФС) |
|
Аспарагин |
0,168 |
0,190 |
0,187 |
|
Треонин |
0,272 |
0,660 |
0,559 |
|
Серин |
0,057 |
0,350 |
0,288 |
|
Глутаминовая кислота |
0,141 |
0,370 |
0,390 |
|
Пролин |
0,044 |
0,380 |
0,395 |
|
Глицин |
0,022 |
0,080 |
0,077 |
|
Аланин |
0,027 |
0,160 |
0,240 |
|
Цистеин |
– |
– |
– |
|
Валин |
0,340 |
0,420 |
0,410 |
|
Метионин |
0,190 |
0,270 |
0,284 |
|
Изолейцин |
0,094 |
0,240 |
0,233 |
|
Лейцин |
0,380 |
0,620 |
0,590 |
|
Тирозин |
– |
0,100 |
0,099 |
|
Фенилаланин |
– |
0,300 |
0,287 |
|
Гистидин |
0,304 |
0,890 |
0,778 |
|
Лизин |
0,063 |
0,150 |
0,142 |
|
Триптофан |
0,290 |
0,580 |
0,520 |
|
Аргинин |
– |
– |
0,010 |
|
Всего |
2,392 |
5,760 |
5,489 |
Анализ аминокислотного состава показал увеличение в процессе гидролиза свободных аминокислот – глутаминовой кислоты, серина, пролина и глицина от 2,5 до 9,0 раза соответственно по сравнению с контрольным вариантом.
Заключение. В результате проведенных исследований была показана возможность применения ферментного препарата КФПА и ферментной системы с тем же комплексом ферментов на степень гидролиза высокомолекулярных белков клейковины. Результаты экспериментов демонстрируют использование ФП КФПА и ферментной системы, что подтверждено материалами исследований. Также увеличение в процессе гидролиза показателей свободных аминокислот играет ключевую роль при составлении рецептур сбалансированных безглютеновых продуктов за счет повышенной усвояемости низкомолекулярных белков.
