Введение. Промышленное животноводство характеризуется интенсивной технологией содержания, для которой характерны высокие технологические нагрузки, направленные на достижение максимальной продуктивности. Подобные условия зачастую являются источником технологического стресса, активируя гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковую ось. Глюкокортикоиды занимают центральное место в гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системе, которая адаптирует организм к изменяющимся условиям среды, мобилизуя энергетические ресурсы и регулируя метаболические процессы [1–3].
Перекисное окисление липидов является основной причиной нарушения клеточных структур, снижения клеточного энергообеспечения и антиоксидантной защиты за счет стресс-индуцированного угнетения процессов синтеза ферментов антиоксидантной системы и их активности.
Установлено, что при стрессе происходит снижение уровня гемоглобина и эритроцитов, что вызывает вторичную тканевую гипоксию, накопление лактата и развитие ацидоза в условиях активирующегося гликолиза. Повышение проницаемости лизосомальных мембран и активация лизосомальных ферментов, в свою очередь, способствуют деструкции клеточных структур и снижению активности ферментов, угнетая антиоксидантную защиту [6].
Нарушения в клеточных структурах, вызванные интенсификацией свободнорадикального окисления ключевых биомолекул (липидов, нуклеиновых кислот, белков), формируют основу для развития многих патологических состояний [5–7].
Противодействует свободнорадикальному окислению эндогенная антиоксидантная система, включающая в себя широкий класс соединений: антиоксидантные ферменты, альбумины, свободные жирные кислоты, комплексоны ионов металлов, витамины и не включенные в перечисленные группы низкомолекулярные соединения, образующие редокс-буфер [4, 5].
Основным плазменным белком с антиоксидантной активностью является церулоплазмин [4, 8, 9]. Он обладает ферроксидазной активностью, окисляя двухвалентное железо до трехвалентного по схеме
Fe2+ ↔ Fe3+ → трансферрин → синтез гема → гемоглобин
Трехвалентное железо (Fe3+) встраивается в молекулу апотрансферрина, образуя трансферрин. Этот комплекс переносит железо в костный мозг для синтеза гема. Установлено, что благодаря ферроксидазной активности церулоплазмин обладает не только антиоксидантной активностью, но и играет ключевую роль в процессе кроветворения и кислородтранспортной функции [9].
Также церулоплазмин обладает активностью супероксидисмутазы, купроксидазы, катализирующей окисление Cu+, NO-оксидазы и глутатион-связанной пероксидазы, активно препятствуя образованию свободных радикалов [4, 8, 9]. Согласно анализу литературных источников, препараты церулоплазмина проявляют также иммуномодулирующее действие [9]. Совокупность ферроксидазной, антиоксидантной и иммуномодулирующей активности позволяет рассматривать эндогенный церулоплазмин как интегральный маркер адаптационного резерва организма.
Для прерывания стресс-индуцированного каскада свободнорадикального окисления требуются дополнительные экзогенные средства, снижающие радикальную нагрузку на эндогенные антиоксидантные системы. К таким относятся средства, нормализующие энергетический обмен, стабилизирующие клеточные мембраны и активизирующие синтез макромолекулярных и надмолекулярных структур [7]. В частности, к ним относятся многие препараты растительного происхождения. Установлено, что препараты на основе сабельника болотного за счет полифенольных соединений подавляют процессы свободнорадикального окисления и стимулируют эндогенную антиоксидантную систему [10,11]. Сухой экстракт сабельника болотного является истинным иммуномодулятором, поскольку проявляет иммуномодулирующее действие только в условиях сниженного иммунитета [12].
Поиск растительного сырья, содержащего большое количество витамина С, показал, что таким сырьем является клюква болотная: содержание этого витамина составляет около 12–20 мг% [15].
Клюква вводится в рецептуру препарата как полифункциональный компонент. Во-первых, витамин С этих ягод обеспечивает синергизм с полифенолами сабельника, повышая антиоксидантный статус предлагаемого препарата. Во-вторых, клюква, применяемая как поливитаминное средство [16], обогащает препарат дополнительными микронутриентами, что расширяет спектр фармакологического действия полученного препарата. Основное фармакологическое действие клюквы связано с содержанием в ягодах проантоцианидинов и флавоноидов. Антоцианы клюквы проявляют антиоксидантное действие и способствуют синтезу белка [17, 18].
В качестве оптимальной формы препарата на основе сабельника и клюквы была выбрана гранулированная форма как наиболее подходящая для использования при автоматизации технологических процессов [19].
В качестве связующего компонента для придания эластичности растительным гранулам был выбран подсолнечный лецитин [22], что связано не только с его технологическим эффектом, но и рядом фармакотерапевтических свойств. Подсолнечный лецитин проявляет антисвободорадикальное действие, способствует снижению уровня холестерина и абсорбции жирорастворимых витаминов, а также образованию активных форм витаминов В [23]. Также в научных исследованиях М.В. Патшиной с соавторами было установлено, что лецитин способствует усилению биодоступности полифенолов [24].
Несмотря на имеющиеся обширные данные о свойствах сабельника, клюквы и лецитина, влияние их комплексного применения в гранулированной форме на уровень церулоплазмина и интегральные показатели адаптационного статуса у высокопродуктивных коров в условиях промышленного комплекса ранее не было изучено.
Цель исследования – оценка влияния разработанного гранулированного препарата на уровень церулоплазмина и другие биохимические и гематологические показатели адаптации у высокопродуктивных коров.
Задачи: изучить влияние гранулированного препарата на уровень церулоплазмина и показатели обмена железа у коров, содержащихся в условиях промышленного комплекса; на соотношение кортизол/инсулин у высокопродуктивных коров в условиях промышленного стресса; на показатели лейкоцитарного профиля у коров, содержащихся в условиях промышленного комплекса; на показатели белково-липидного обмена у опытных коров.
Достижение поставленной цели было основано на гипотезе о том, что применение гранулированного препарата будет способствовать повышению уровня эндогенного церулоплазмина и улучшению показателей белково-липидного профиля и иммунного статуса у коров.
Объекты и методы. Работа была выполнена в период 2018–2024 гг. Экспериментальная часть проводилась на базе промышленного комплекса ООО «Маслово», аналитические исследования – на базе кафедры биотехнологии и химии имени профессора Н.Е. Павловской и в ИНИИ ЦКП ФГБОУ ВО Орловский ГАУ им. Н.В. Парахина.
Было изучено влияние скармливания дополнительно к основному рациону в течение 21 суток растительного гранулированного препарата из сабельника, клюквы и лецитина в дозе 2,15 г на 1 кг живой массы. Гранулированный препарат, состоящий из сабельника болотного, ягод клюквы и подсолнечного лецитина, был изготовлен по методике, зарегистрированной в нашем патенте РФ № 2844375.
Сабельник болотный и клюква дикорастущая были заготовлены на территории Республики Коми.
В качестве объекта эксперимента были выбраны коровы голштинизированной породы, содержащиеся в промышленных условиях комплекса ООО «Маслово». По принципу пар-аналогов были сформированы две группы численностью по 10 голов каждая. Животные контрольной группы получали рацион, принятый в хозяйстве (ОРХ). Животные опытной группы дополнительно к ОРХ получали разработанный гранулированный препарат.
Для оценки состояния опытных животных анализировали кровь и сыворотку крови. Кровь для исследований отбирали у коров в утренние часы перед кормлением из яремной вены с соблюдением правил асептики и антисептики.
Уровень церулоплазмина у животных определяли с помощью экспресс-метода по Э.В. Тэну (1981). Уровень кортизола у коров определяли в лаборатории «Vet Union» (г. Москва).
В цельной крови на гематологическом анализаторе «DH36-Vet» определяли гематологические показатели.
Полученные экспериментальные данные были статистически обработаны. Данные представлены в статье в виде M ± SD, где М – среднее арифметическое, SD – стандартное отклонение. Для оценки статистической значимости различий между показателями у коров сравниваемых групп использовали критерий Стьюдента.
Результаты и их обсуждение. Одним из основных показателей уровня свободнорадикального окисления является малоновый диальдегид (МДА). Как было показано нами ранее [25], исходно у животных обеих групп на 1-е сутки эксперимента значение малонового диальдегида (МДА) было выше нормы. К 21-м суткам опыта в крови коров опытной группы уровень МДА был в пределах нормы, при этом уровень МДА у животных контрольной группы оставался выше нормы. Снижение уровня МДА было сопряжено с положительной динамикой основного антиоксиданта крови – церулоплазмина.
В начале эксперимента уровни церулоплазмина и эритроцитов у всех животных были ниже нормы. У коров контрольной группы данное состояние сохранялось до конца опыта. Концентрация гемоглобина у коров контрольной и опытной групп в течение всего эксперимента сохранялась в пределах референтных значений, равных 90–115 г/л. Влияние гранулированного препарата на содержание церулоплазмина в крови коров опытной и контрольной групп представлено на рисунке 1.
Здесь и далее: * – р < 0,05, ** – р < 0,01 относительно контрольной группы коров, получавших только основной рацион.
Рис.1. Динамика церулоплазмина в сыворотке крови коров при применении гранулированного препарата
Dynamics of ceruloplasmin in the blood serum of cows with the use of a granular preparation
Как видно из рисунка 1, введение растительного гранулированного препарата на основе сабельника болотного, клюквы и подсолнечного лецитина дополнительно к основному рациону коров промышленного содержания положительно влияет на уровень церулоплазмина. К концу эксперимента концентрация церулоплазмина в сыворотке крови коров увеличилась на 34 % (p < 0,05) относительно коров контрольной группы, достигнув нормальных значений, равных 1,84–2,3 мкмоль/л.
Увеличение церулоплазмина в крови коров опытной группы, получавших дополнительно к основному рациону гранулированный препарат, сопровождалось повышением содержания эритроцитов до 6,8 ± 0,07 · 1012/л, т. е. было выше на 23 % (p < 0,05), чем в контроле, что соответствовало середине референтных значений, равных 5,5–8,5 · 1012/л. Также установлено повышение концентрации гемоглобина до (114,17 ± 0,51) г/л, что было на 10 % (p < 0,05) больше по сравнению с контролем. Стимуляция выработки эндогенного церулоплазмина приводит к улучшению кислородтранспортной функции у животных опытной группы.
Вышеперечисленные нарушения в морфобиохимических показателях, включая антиоксидантную систему, у коров в начале эксперимента проявлялись также в содержании кортизола. На начало эксперимента концентрация кортизола в сыворотке крови коров двух групп приближалась к верхней границе референтного интервала (норма 26–90 нмоль/л); в контрольной группе уровень кортизола сохранялся на высоком уровне до окончания эксперимента. Влияние гранулированного препарата на данный показатель представлено на рисунке 2.
По данным рисунка 2, введение гранулированного препарата дополнительно к основному рациону способствовало снижению концентрации кортизола в крови коров опытной группы на 33 % (p < 0,05) относительно контроля.
Оценка стрессовой реакции только по уровню глюкокортикоидов может быть недостаточной, так как характер эндокринного ответа может меняться. В связи с этим в качестве более устойчивого маркера предлагается использовать соотношение кортизол/инсулин. Его повышение указывает на возрастание состояния напряжения и истощение адаптационного резерва [26, 27].
Согласно исследованиям С.С. Алексанина с соавт. [26], соотношение кортизол/инсулин оценивали по отношению к референтной медиане. Данная медиана была рассчитана как частное медиан референтных диапазонов для кортизола (нмоль/л) и инсулина (пмоль/л) и составила 0,6 [26].
Рис. 2. Динамика изменения уровня кортизола в сыворотке крови высокопродуктивных коров экспериментальных групп при использовании в кормлении гранулированного препарата
Dynamics of cortisol level changes in serum of high-yielding cows during of the experimental groups when using a granular preparation
К 21-м суткам опыта медиана значений индекса кортизол/инсулин у контрольной группы коров составила 1,1, что было выше рассчитанной референтной медианы. Это изменение указывает на снижение адаптационного резерва животных и состояние напряжения у них. Величина индекса у контроля превышала рассчитанную референтную медиану в 1,8 раза. Изменение показателя кортизол/инсулин при скармливании гранулированного препарата показано на рисунке 3.
Рис. 3. Динамика изменения индекса кортизол/инсулин (×103) в сыворотке крови высокопродуктивных коров при скармливании гранулированного препарата дополнительно к основному рациону
Dynamics of the cortisol/insulin index (×0³) changes in the serum of high-yielding cows when fed a granular preparation in addition to the main diet
Согласно данным рисунка 3, введение дополнительно к основному рациону коров гранулированного препарата привело к тому, что к 21-м сут эксперимента (концу эксперимента) индекс кортизол/инсулин был ниже контроля в 1,62 раза (p < 0,05) и приближался к рассчитанной референтной медиане, достигнув значения 0,68.
Таким образом, на фоне повышения эндогенного церулоплазмина в крови опытных коров произошла нормализация индекса кортизол/инсулин, как одного из показателей адаптационного резерва.
Наблюдаемые нарушения исследуемых показателей у высокопродуктивных коров в условиях промышленного комплекса сопровождались изменениями в лейкоцитарной формуле, а именно нейтрофилезом и эозинопенией. Введение гранулированного препарата вызвало следующие положительные изменения лейкоцитарного профиля (рис. 4).
Рис.4. Сравнительный анализ лейкоцитарной формулы крови коров, содержащихся в стрессогенных условиях промышленного комплекса
Comparative analysis of the leukocyte formula of blood in cows kept under stress conditions of an industrial complex
Согласно анализу рисунка 4, в крови коров обеих групп в начале опыта содержание нейтрофилов было выше нормы (норма 30–36 %), в контрольной группе данный показатель оставался таковым на протяжении всего эксперимента. К 21-м сут эксперимента в опытной группе, получавшей дополнительно к основному рациону гранулированный препарат, количество нейтрофилов нормализовывалось и было ниже на 17 % (р < 0,05) относительно контрольной группы.
В первый день эксперимента было установлено, что уровень эозинофилов в контрольной и опытной группах был ниже референтных значений, равных 6–8 %, данное состояние сохранялось у животных контрольной группы на протяжении 21 сут опыта. Согласно научной литературе, снижение количества эозинофилов говорит об усилении работы коры надпочечников и увеличении функционального напряжения в организме [28–30]. При введении в рацион коров опытной группы гранулированного препарата из сабельника, клюквы и лецитина к концу эксперимента уровень эозинофилов достиг значений (6,40 ± 1,33) %, что соответствовало референтным значениям и было в 2 раза выше (р < 0,05), чем значения этих показателей у коров контрольной группы. Повышение уровня эозинофилов у коров опытной группы может косвенно указывать на снижение адаптационного напряжения в организме.
На начало эксперимента уровень лимфоцитов у коров обеих групп находился в пределах референтных значений, равных 40–65 %. При дополнительном введении в рацион опытной группы животных гранулированного препарата к концу эксперимента отмечалось повышение уровня данного показателя до (54,50 ± 2,33) %, что было выше на 6 % (р < 0,05) по сравнению с контролем. По мнению Д.И. Березиной, это также может косвенно свидетельствовать о снижении синтеза кортикостероидов и повышении активности процессов адаптации [29].
Концентрация моноцитов в обеих группах находилась в пределах нормы на всем протяжении эксперимента. Однако к концу опыта у коров опытной группы было зафиксировано статистически значимое увеличение уровня моноцитов до значений (4,90 ± 1,45) %, что входило в пределы референтных значений. В контрольной группе уровень моноцитов, находясь в пределах нормы, к 21-м суткам имел тенденцию к снижению, что, вероятно, связано со стрессогенной технологией промышленного содержания, которую можно рассматривать как хронический стресс, вызывающий иммуносупрессивное действие на организм [30].
Таким образом, скармливание дополнительно к основному рациону коров гранулированного препарата на основе сабельника болотного, плодов клюквы дикорастущей и подсолнечного лецитина положительно отразилось на лейкоцитарном профиле у животных опытной группы, проявляя тем самым иммуномодулирующее действие.
При воздействии стресс-факторов и при адаптации к их длительному действию у сельскохозяйственных животных отмечаются изменения в белково-липидном обмене.
Содержание общего белка в крови коров контрольной группы на протяжении всего эксперимента находилось в пределах (69 ± 1,14) – *71,6 ± 1,92) г/л, а у опытной группы в его начале (69,1 ± 0,99) г/л. Содержание белка в обеих группах в начале эксперимента находилось у нижней границы референтного интервала, равного (72,0–86,0) г/л. Однако введение в рацион опытной группы гранулированного препарата привело к достоверному повышению данного показателя до уровня (83,7±1,05) г/л. По сравнению с контрольной группой уровень общего белка к концу эксперимента у коров, получавших препарат, был выше на 14 % (p < 0,05).
Концентрация мочевины была ниже нормы в крови коров контрольной группы и составила (1,5 ± 0,84) – (1,6 ± 2,12) ммоль/л на протяжении всего исследования, тогда как у коров опытной группы концентрация была ниже нормы только в начале эксперимента (1,61 ± 0,11) ммоль/л. На фоне применения гранулированного препарата в опытной группе было зафиксировано достоверное повышение данного показателя до (3,27 ± 0,18) ммоль/л. К 21-м суткам концентрация мочевины в опытной группе приблизилась к нижней границе референтного интервала и превышала показатель контрольной группы на 51 % (p < 0,05).
Содержание мочевой кислоты в крови коров контрольной и опытной групп на протяжении всего эксперимента находилось в пределах референтного интервала, равного 60–120 мкмоль/л. Однако введение в рацион опытной группы гранулированного препарата на основе сабельника, клюквы и лецитина привело к снижению данного показателя, который к концу эксперимента был равен (76 ± 1,41) мкмоль/л и стал на 32 % (p < 0,05) ниже, чем в контроле.
Исходно гиперхолестеринемия отмечалась и в контрольной (4,63 ± 1,0) ммоль/л, и опытной (4,8 ± 0,11) ммоль/л группах при норме 1,30–4,42 ммоль/л. В то время как у контрольных животных она сохранялась (4,78 ± 0,12) ммоль/л, применение гранулированного препарата привело к нормализации холестерина к концу опыта (3,2 ± 0,09) ммоль/л, при этом эти значения были на 33 % (p < 0,05) ниже, чем у коров контрольной группы.
На начало эксперимента в крови коров обеих групп содержание триглицеридов превышало референтные значения (норма 0,22–0,60 ммоль/л). У коров контрольной группы это состояние сохранялось в течение всего периода исследования. К 21-м суткам эксперимента уровень триглицеридов у опытных коров снизился до (0,5 ± 0,01) ммоль/л, что на 43 % (p < 0,05) ниже значений контрольной группы (0,88 ± 0,01 ммоль/л), в которой животные получали только основной рацион.
Таким образом, применение в течение 21 сут растительного гранулированного препарата на основе сабельника, клюквы и подсолнечного лецитина вызвало комплексную положительную динамику показателей липидного и белкового обменов. Наблюдаемое повышение общего белка и мочевины до уровня референтных значений на фоне одновременного снижения мочевой кислоты говорит об активации белкового синтеза и улучшении азотистого обмена. Одновременная коррекция показателей липидного обмена указывает на восстановление метаболического гомеостаза у коров за счет повышения адаптационного резерва животных в условиях промышленного стресса.
Заключение. Проведенное исследование позволило установить, что скармливание высокопродуктивным коровам в условиях промышленного комплекса гранулированного препарата на основе сабельника болотного, клюквы и подсолнечного лецитина в течение 21 суток оказывает комплексное адаптогенное действие. Гранулированный препарат стимулирует эндогенный синтез церулоплазмина и улучшает метаболизм железа, что подтверждается достоверным повышением количества эритроцитов и уровня гемоглобина. Применение препарата способствует повышению адаптационного резерва, оцененного по индексу кортизол/инсулин, и снижению уровня кортизола, что свидетельствует о повышении устойчивости организма к технологическому стрессу. В опытной группе зафиксировано повышение уровня общего белка и мочевины до физиологической нормы, а также коррекция липидного профиля (по холестерину и триглицеридам), что указывает на нормализацию показателей белково-липидного статуса. Гранулированный препарат проявляет иммуномодулирующую активность, выражающуюся в нормализации лейкоцитарной формулы.
Таким образом, разработанный гранулированный препарат является эффективным средством для коррекции стресс-индуцированных нарушений в морфобиохимических показателях, включая антиоксидантную систему, и повышения адаптационного потенциала высокопродуктивных коров в условиях промышленного содержания.
