Russian Federation
Russian Federation
from 01.01.2013 until now
Krasnoyarsk, Krasnoyarsk, Russian Federation
Krasnoyarsk, Krasnoyarsk, Russian Federation
The aim of the study was to develop a protective medium for lyophilization of a strain of non-symbiotic nitrogen-fixing bacteria isolated by the authors from agricultural soils of the Krasnoyarsk Region and identified as Azotobacter sp. The strain was incubated on Sabouraud's modified nutrient medium at 25 °C for 7 days. After incubation, bacterial cells were suspended in protective media and lyophilized using a Bio-Rus-4SFD lyophilizer. Three protective media were used: standard gelatin-sucrose agar (sucrose 10 %, gelatin 1.5, agar 0.01 %), recommended by the All-Russian Collection of Microorganisms; gelatin-sucrose agar with the addition of 1 % ascorbic acid as an antioxidant; peptone-sucrose-glycerol mixture developed by the authors (distilled water 90 ml, glycerol 10 ml, sucrose 10 g, peptone 3.2 g). Bacterial cells suspended in distilled water without lyoprotectors were used as controls. The viability of lyophilized cells was assessed by their ability to form microcolonies on the agar culture medium using phase contrast microscopy. The viability of bacterial cells after lyophilization in distilled water (control) was 8.04%; after lyophilization in standard gelatin-sucrose agar – 9.92 %; after lyophilization in a peptone-sucrose-glycerol mixture developed by the authors – 12.89 %. The difference between these protective media in terms of cell viability is statistically significant at the level of P < 0.05 according to the chi-square test (χ2). No viable cells were found after lyophilization in gelatin-sucrose agar with the addition of 1% ascorbic acid. Thus, the protective medium developed by us provides an increase in the proportion of viable cells during lyophilization by 1.3 times in comparison with standard gelatin-sucrose agar.
non-symbiotic nitrogen-fixing bacteria, lyophilization, protective media, biofertilizers
Введение. Одним из важнейших направлений биологизации сельского хозяйства является замена химических удобрений на микробиологические – в первую очередь на биопрепараты на основе азотфиксирующих микроорганизмов [1–3]. При этом при выборе штаммов для производства биопрепаратов предпочтение следует отдавать автохтонным, выделенным из местных почвенных и ризосферных сообществ и, соответственно, эволюционно адаптированных к местным почвенно-климатическим условиям и способным эффективно функционировать в данном сообществе [4].
Ключевой проблемой при практическом использовании штаммов в биотехнологических процессах, включая производство микробиологических удобрений, является их сохранение в микробиологической коллекции. Сохранение штаммов методом регулярных пересевов на свежую питательную среду, помимо высокой трудоемкости, несет риски утраты штаммом полезных свойств в результате автоселекции, а также контаминации культуры посторонними микроорганизмами. В этой связи наиболее надежным способом длительного сохранения штаммов микроорганизмов в жизнеспособном состоянии является лиофилизация, то есть сублимационное высушивание микробных культур из замороженного состояния [5, 6]. Ключевой и до сих пор нерешенной проблемой лиофилизации является повреждение микробных клеток на различных стадиях процесса лиофилизации, приводящее к утрате ими жизнеспособности. Для снижения гибели микробных клеток при лиофилизации применяют разнообразные защитные (лиопротективные) среды, состав которых для каждого микроорганизма подбирают эмпирически [7].
В ходе выполнения научно-исследовательской работы по тематическому плану-заданию по заказу Минсельхоза РФ за счет средств федерального бюджета «Разработка комплексного биопрепарата для защиты пшеницы от фузариоза и улучшения обеспеченности пшеницы азотом в условиях Сибири» из почвы местного агроценоза нами был выделен быстрорастущий штамм азотфиксирующих бактерий OSV-2, по совокупности культурально-морфологических свойств идентифицированный как представитель р. Azotobacter.
Цель исследований – подбор защитной среды для лиофилизации азотфиксирующего штамма OSV-2, обеспечивающей приемлемое с точки зрения сохранения штамма выживание микробных клеток.
Задачи: проверка возможности сохранения жизнеспособности штамма OSV-2 при лиофилизации без использования защитных сред, с использованием стандартных защитных сред; разработка защитной среды, обеспечивающей повышенное выживание клеток в сравнении со стандартными средами.
Объекты и методы. Штамм представляет собой аспорогенные грамотрицательные аэробные палочки; при выращивании на жидкой среде в молодой культуре – подвижные. Клетки плеоморфные, от коротких палочковидных до округлых, одиночные, в парах, в тетрадах и в неправильных скоплениях, редко – в коротких цепочках. При старении культуры склонны к образованию слизистой капсулы; клетки под капсулами кокковидные, могут достигать больших размеров; размер палочковидных клеток 2,6–4,2×2,1–3,5 мкм; диаметр кокковидных клеток без капсул 1,8–2,5 мкм; диаметр кокковидных клеток под капсулами 2,6–4,0 мкм (рис. 1).
Рис. 1. Клетки штамма OSV-2 (длина масштабной полоски 10 мкм)
Колонии в молодой культуре округлые бесцветные морщинистые, в более старой культуре – бесцветные слизистые.
Штамм хорошо растет на безазотистой среде Эшби с маннитом в качестве источника углерода и с микросолями по Федорову, а также на среде № 2 ГРМ (Сабуро) производства ФБУН ГНЦ ПМБ, разведенной в 2 раза и дополненной агаром до 15–20 г на 1 л среды.
Штамм выращивали в чашках Петри на среде № 2 ГРМ (Сабуро), разведенной в 2 раза и дополненной агаром до 20 г/л при 25 °С в течение 7 сут, после чего суспендировали клетки в одной из защитных сред и лиофилизировали в лиофильной сушилке Bio-Rus-4SFD следующем режиме: стадия замораживания при -36 °C в течение 5 ч; основная сушка при -40 °C в течение 15 ч при давлении 60 Па; вторичная сушка с шагом от 5 до 15 °C при давлении 80 Па в течение 5 ч [8, 9].
В качестве стандартных защитных сред использовали среду Файбича (сахарозо-желатиновый агар) и среду Файбича с 1% аскорбиновой кислоты в качестве антиоксиданта [10]. Выбор среды Файбича обусловлен тем, что она широко используется в России в качестве лиопротектора [11] и, в частности, является основной средой для лиофилизации бактерий и дрожжей в крупнейшей в России по разнообразию поддерживаемых культур Всероссийской коллекции микроорганизмов на базе Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук [12]. В качестве новой защитной среды использовали разработанную авторами на основе анализа литературных данных композицию следующего состава: пептон ферментативный сухой – 3,2 г; сахароза – 10 г; глицерин – 10 мл; вода дистиллированная – 90 мл.
Контролем служили клетки, суспендированные в дистиллированной воде без добавления лиопротекторов.
Определение жизнеспособности выживших клеток проводили прямым методом. Суспензию лиофилизированных клеток наносили на агаризованную питательную среду и инкубировали при температуре 25 °С. После 12 ч инкубирования определяли соотношение выживших и мертвых клеток с помощью фазово-контрастной микроскопии in situ с последующим подтверждением способности клеток к формированию микроколоний через 24 и 36 ч инкубирования после посева (рис. 2). Долю выживших клеток определяли как отношение числа микроколоний к сумме погибших клеток и микроколоний на поверхности среды.
Рис. 2. Погибшие (1), выжившие (2) при лиофилизации клетки и формирование микроколонии (3) выжившими при лиофилизации клетками азотфиксирующего штамма;
длина масштабной полоски 10 мкм
Результаты и их обсуждение. Максимальное выживание клеток изучаемого штамма (12,89 %) отмечено при использовании разработанной авторами композиции на основе пептона, сахарозы и глицерина. На втором месте по выживаемости – среда Файбича (9,92 %), на третьем – контроль без лиопротекторов (8,04 %) (рис. 3).
Рис. 3. Выживаемость клеток азотфиксирующего штамма
при лиофилизации с использованием защитных сред
Статистическая значимость различий между указанными вариантами по выживаемости клеток, согласно тесту χ2, составляет p < 0,05.
В противоположность указанным вариантам в варианте с использованием среды Файбича с 1 % аскорбиновой кислотой выживших клеток не обнаружено (рис. 4).
При дальнейшем инкубировании микроколонии в вариантах, лиофилизированных без лиопротекторов (контроль), а также при использовании в качестве защитных сред среды Файбича и авторской композиции, нормально развивались; в варианте со средой Файбича с 1% аскорбиновой кислоты рост отсутствовал (рис. 5).
Рис. 4. Характерный вид культуры на питательной среде после лиофилизации с использованием разных защитных сред: 1 – контроль; 2 – среда Файбича; 3 – среда Файбича с аскорбиновой кислотой; 4 – авторская композиция; видны одиночные нежизнеспособные клетки и микроколонии
(показаны стрелками)
Рис. 5. Характерный вид культуры на питательной среде после лиофилизации с использованием разных защитных сред после 36 ч инкубирования: 1 – контроль, 2 – среда Файбича, 3 – среда Файбича с аскорбиновой кислотой, 4 – авторская композиция
Таким образом, разработанный нами состав защитной среды обеспечивает при лиофилизации повышение выживаемости несимбиотического азотфиксирующего штамма, перспективного для применения в качестве микробиологического удобрения в условиях Сибири, в 1,3 раза в сравнении со стандартной защитной средой Файбича.
Следует отметить, что достигнутая нами выживаемость клеток (12,89 %) при лиофилизации может считаться очень хорошим показателем. Известно, что бактерии, образующие полисахаридную капсулу (к которым относится и использованный в работе штамм Azotobacter sp.), плохо переносят лиофилизацию. Так, максимальное число выживших после лиофилизации с использованием желатин-сахарозной, молочно-глюкозной и молочной защитных сред клеток у разных штаммов Azotobacter chroococcum варьировало от 8,0×103 до 1,2×106 при стартовой численности суспензии 109–1010 клеток, то есть максимальная выживаемость не превышала 0,1 % [13]. Есть основания полагать, что дальнейшая оптимизация разработанной нами смеси на основе пептона, сахарозы и глицерина позволит дополнительно усилить ее лиопротекторные свойства.
Заключение
- Разработанная нами лиопротекторная композиция на основе пептона, сахарозы и глицерина применительно к изучаемому штамму Azotobacter sp. по своим защитным свойствам в 1,3 раза превышает рекомендованную Всероссийской коллекцией микроорганизмов среду Файбича.
- Введение в среду Файбича 1 % аскорбиновой кислоты в качестве антиоксиданта, в соответствии с рекомендациями М.М. Файбича, ведет к полной гибели клеток изучаемого штамма при лиофилизации.
1. Exploiting biological nitrogen fixation: a route towards a sustainable agriculture / A. Soumare [et al.] // Plants. 2020. Vol. 9, № 8. DOI:https://doi.org/10.3390/plants9081011.
2. Nitrogen fixing Azotobacter species as potential soil biological enhancers for crop nutrition and yield stability / A. Aasfar [et al.] // Front. Microbiol. 2021. DOI:https://doi.org/10.3389/fmicb.2021.628379.
3. Biofertilizer: the future of food security and food safety / A.I. Daniel [et al.] // Microorganisms. 2022. Vol. 10, № 6. P. 1220. DOI:https://doi.org/10.3390/microorganisms10061220.
4. Microbial community and function-based synthetic bioinoculants: a perspective for sustainable agriculture / A. Suman [et al.] // Front. Microbiol. 2022. DOI:https://doi.org/10.3389/fmicb.2021.805498.
5. Adams J. The principles of freeze-drying // Methods Mol. Biol. 2007. Vol. 368. P. 15–38. DOI:https://doi.org/10.1007/978-1-59745-362-2_2.
6. Stacey J.N., Day J. Long-term ex-situ conservation of biological resources and the role of biological resource centers // Methods Mol. Biol. 2007. Vol. 368. P. 1–14. DOI: 10.1007/ 978-1-59745-362-2_1.
7. Gracheva I.V., Osin A.V. Mehanizmy povrezhdeniy bakteriy pri liofilizacii i protektivnoe deystvie zaschitnyh sred // Problemy osobo opasnyh infekciy. 2016. № 3. S. 5–12. DOI:https://doi.org/10.21055/0370-1069-2016-3-5-12.
8. Impact of the fermentation parameters pH and temperature on stress resilience of Lactobacillus reuteri DSM 17938 / A. Hernandez [et al.] // AMB Expr. 2019. Vol. 9. № 66. DOI: 10.1186/ s13568-019-0789-2.
9. Optimization of protective agents for the freeze-drying of Paenibacillus polymyxa Kp10 as a potential biofungicide / H.S. Nasran [et al.] // Molecules. 2020. Vol. 25, № 11. DOI:https://doi.org/10.3390/molecules25112618.
10. Faybich M.M. Stabilizaciya vakcinnyh preparatov v processe vysushivaniya i hraneniya // Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunologii. 1968. № 2. S. 59–66.
11. Ohapkina V.Yu. Metody podderzhaniya mikrobnyh kul'tur. Ch. 2. Liofilizaciya // Teoreticheskaya i prikladnaya ekologiya. 2009. № 4. S. 21–32.
12. Standartnaya operacionnaya procedura po liofilizacii kul'tur VKM s ispol'zovaniem raznyh rezhimov pervichnoy i vtorichnoy sushki / cost. S.M. Ozerskaya, E.O. Puchkov, N.E. Ivanushkina. Puschino, 2011.
13. Kupletskaya M.B., Netrusov A.I. Zhiznesposobnost' liofilizirovannyh mikroorganizmov posle 50 let hraneniya // Mikrobiologiya. 2011. T. 80, № 6. S. 842–846.
