The goal is to review domestic and foreign experience in the study and production of starter cultures using the freeze-drying method. Lactic acid bacteria are one of the most common microorganisms used in the food industry. They play an important role in the production of fermented milk products, cheeses, cottage cheese and other dairy products. However, to use them, it is necessary to cultivate and preserve starter cultures, which requires certain technological processes. There are several methods for cultivating and storing lactic acid bacteria, one of which is the freeze-drying method. This method makes it possible to preserve starter cultures for a long time without losing their viability and activity. The main objective of the study is to analyze scientific papers, publications and reports on the application of the freeze-drying me¬thod for the production of starter cultures. The study revealed the main advantages and disadvantages of this method, and also determined the conditions for the cultivation and sublimation of starter cultures. An important result of the study is the creation of a database that will help optimize the production of star-ter cultures and create new logistics networks in the food industry. The database will contain information on the application of the freeze-drying method for the production of various types of starter cultures, as well as on cultivation and freeze-drying regimes. The results of the study can be used in the food industry to create new products based on starter cultures, as well as to optimize the production of existing pro-ducts. In addition, the study may be useful for researchers studying starter cultures and their production methods.
starters, cryopreservation, lactic acid bacteria, cryoprotector
Введение. Пищевые продукты и биологически активные вещества производятся с помощью таких микроорганизмов, как вирусы, бактерии, дрожжи, споры грибов и простейшие. В свою очередь, молочнокислые бактерии используются для производства кисломолочных продуктов, таких как сыры, творог и многие другие. Совершенствование технологий для организации производства культур – одно из наиболее перспективных направлений пищевой промышленности [1–5].
В последнее время в российском пищевом бизнесе наблюдается множество технологических изменений. Нарушение сложившихся цепочек поставок заквасок, реагентов, оборудования в результате пандемии коронавируса в 2019 г. оказало существенное влияние на развитие отрасли.
Недостаточность отечественной технологии производства заквасочных культур и производителей оборудования, необходимость развития технологических процессов, создание новых логистических сетей – актуальные проблемы пищевой отрасли
Цель исследования – обзор отечественного и зарубежного опыта изучения и производства заквасочных культур методом сублимационной сушки.
Задачи: изучение технологии и методики лиофилизации заквасочных культур, используемых в различных странах; определение основных параметров и условий лиофилизации, которые влияют на качество заквасочных культур.
Объекты. Объектом настоящего обзора является технология культивирования и лиофилизации молочнокислых бактерий, применяемых в пищевой промышленности.
Результаты и их обсуждение
Накопление бактериальной массы
Накопление бактериальной массы является важным этапом культивирования бактерий и является необходимым для получения достаточного количества бактерий для дальнейших исследований или производства биологических продуктов. Факторы, влияющие на накопление бактериальной массы при культивировании, могут быть различными и зависят от условий, в которых происходит культивирование.
Один из основных факторов, влияющих на накопление бактериальной массы, – это тип и состав питательной среды [7]. Различные виды бактерий могут требовать разных компонентов питательной среды для роста и размножения. Некоторые бактерии могут производить экзотоксины, которые убивают другие виды бактерий [8], что может привести к низкому накоплению бактериальной массы. В промышленности существует риск контаминации и поражения заквасочных культур бактериофагами, способными привести к гибели молочнокислых бактерий [9].
Температура также является важным фактором, влияющим на накопление бактериальной массы. Различные виды бактерий имеют оптимальные температуры для роста и размножения. Если температура слишком высокая или низкая, это может привести к замедлению роста бактерий и низкому накоплению бактериальной массы.
К другим факторам, влияющим на накопление бактериальной массы, относятся pH питательной среды, содержание кислорода в среде, наличие антибиотиков или других ингибиторов роста, а также интенсивность перемешивания и аэрации в культуре. Все эти факторы могут оказывать как положительное, так и отрицательное влияние на накопление бактериальной массы. Анализ открытых источников литературы выявил 15 наиболее важных факторов, представленных на рисунке 1, способных повлиять как на накопление биомассы, так и на конечный результат лиофилизации – выживаемость бактерий [10–13].
Рис. 1. Факторы, влияющие на накопление бактериальной массы при культивировании
Кроме вышеперечисленных факторов, при культивировании бактерий также необходимо учитывать состав мембраны бактерий, поскольку он может влиять на проницаемость и способность бактерий к поглощению питательных веществ. Также важен выбор правильного метода пассажа, который позволяет сохранить стабильность генетического материала бактерий при последовательных пересевах. Вид и штамм бактерий также могут влиять на эффективность культивирования, поскольку различные виды и штаммы могут иметь разные требования к условиям культивирования и чувствительность к антибиотикам и ингибиторам роста [14].
При культивировании бактерий необходимо учитывать все эти факторы для достижения максимального эффекта и получения качественной бактериальной массы.
Известно, что при снижении температуры большинство биологических и химических реакций замедляется, что и приводит к консервации процессов. Анабиотическое состояние, в которое возможно искусственно ввести микроорганизмы, является основой всех эффективных методов хранения образцов [11, 15–23]. Однако процесс заморозки зачастую губителен для клеток, органелл и других структур ввиду образования интра- и экстраклеточных кристаллов воды [15].
Лиофилизация бактериальной массы
Для сохранения видового состава и разнообразия, стабилизации бактериальных клеток, уменьшения энергозатрат при хранении проводят лиофильную сушку. Лиофильная сушка является наиболее распространенным методом сохранения биологических объектов, в том числе молочнокислых бактерий, что облегчает их хранение и транспортировку без трудоемкой и дорогостоящей холодильной цепи. В основе лиофильного высушивание лежит двойной фазовый переход: вода–лед (замораживание) и лед–пар (сублимация) [11, 16, 20]. На процесс лиофилизации влияет множество факторов: скорость заморозки, тип криопротектора, изначальная концентрация микроорганизмов и другие, представленные на рисунке 2. В рамках работы было изучено более трехсот публикаций отечественных и зарубежных исследовательских групп, из которых было отобрано 16 наиболее важных факторов, влияющих на выживаемость бактерий при лиофилизации. Для успешной выживаемости бактерий следует не только учитывать вышеупомянутые факторы, но также условия хранения высушенных образцов, например температуру хранения. Более того, следует принять во внимание степень обезвоживания образцов [18, 24–26].
Рис. 2. Факторы, влияющие на выживаемость бактерий при лиофилизации
В основе низкотемпературного хранения образцов лежит процесс замерзания воды и концентрации растворенных веществ в незамерзшей жидкой фазе. Считается, что механическое повреждение вызвано кристаллами льда, образованными при снижении температуры [18]. Ввиду этого необходимым является использование веществ, предотвращающих формирование льда, – антифризов или криопротекторов. Процесс криозащиты заключается в способности реагента предотвращать нуклеацию. Это необходимо, поскольку нуклеация вызывает разрушение таких структур, как лизосомы. Более того, нуклеация часто приводит к летальному исходу [24]. Криоконсервация является эффективным методом долгосрочного хранения образцов. Благодаря данному методу не только снижаются временные и финансовые затраты, но также обеспечивается стабильность образцов, поскольку риски генетических изменений снижаются [12].
В качестве лиоопротекторов могут выступать многие вещества: углеводы (трегалоза, сахароза), полисахариды, спирты (глицерин), натуральные биополимеры (белки, полисахариды) и другие [12, 14, 15, 18, 27, 28]. Однако не все традиционно используемые криопротекторы (например, ДМСО) могут быть применены в пищевой промышленности ввиду их токсичности. Зачастую для лиофилизации создают многокомпонентный криопротектор, используя комбинацию соединений с различными защитными свойствами [7, 10, 12].
Действие криопротектора обусловлено предотвращением физико-химических и фазовых превращений вследствие осмотического обезвоживания бактериальных клеток – предупреждением образования внутриклеточных кристаллов льда, органических и минеральных солей, которые вызывают разрыв клеточной стенки. Наличие криопротектора также определяет процесс оттаивания, который может сопровождаться перекристаллизацией [23]. При медленном подводе тепла меньшие по размеру кристаллы льда могут перекристаллизовываться в более крупные, неоднородные по форме, что может вызвать разрыв клеточных структур и повреждение клеточной стенки.
Разработка композиций криопротекторов и изучение взаимодействия их молекул с клеточной стенкой бактерий позволит оптимизировать разработку криозащитных добавок для заквасок молочнокислых бактерий, применяемых в пищевой промышленности, а также создание базы данных для дальнейшего изучения данной области с применением алгоритмов и методов машинного обучения [29].
Заключение. В рамках данной работы был проведен обширный анализ отечественной и зарубежной литературы по культивированию молочнокислых бактерий и их дальнейшей лиофилизации. Целью данного анализа являлось определение параметров для создания базы данных, которая будет способствовать развитию цифровой модели процесса лиофилизации бактерий. Для достижения цели были изучены различные источники информации, включая научные статьи, книги, патенты и другие материалы. Были проанализированы различные аспекты процесса культивирования молочнокислых бактерий, такие как условия роста, состав среды, температура, pH и другие факторы. Также были изучены факторы, влияющие на дальнейшую лиофилизацию молочнокислых бактерий, такие как методы замораживания, тип сушки, скорость замораживания и другие параметры. В результате анализа была создана база данных, которая включала информацию о наиболее эффективных методах культивирования молочнокислых бактерий и их последующей лиофилизации. Эта база данных может быть использована для разработки новых методов культивирования молочнокислых бактерий и их дальнейшей обработки, а также для оптимизации существующих процессов. Кроме того, она может быть полезна для исследователей, занимающихся различными аспектами молочнокислых бактерий, включая их использование в пищевой промышленности, медицине и других областях.
1. Izuchenie vliyaniya BAV lekarstvennyh rastenij na rost i razvitie molochnokislyh mikroor-ganizmov i bifidobakterij / T.V. Gerasimova [i dr.] // Tehnika i tehnologiya pischevyh proiz-vodstv. 2012. № 1 (24). S. 26–30.
2. Nogovicina E.M. Ispol'zovanie bakterij dlya polucheniya biologicheski aktivnyh soedinenij na osnove rastitel'nyh sterolov // Vestnik Perm¬skogo federal'nogo issledovatel'skogo centra. 2013. № 2. S. 4–12.
3. Nosov A.M. Ispol'zovanie kletochnyh tehnolo-gij dlya promyshlennogo polucheniya biologi-cheski aktivnyh veschestv rastitel'nogo prois-hozhdeniya // Biotehnologiya. 2010. № 5. S. 8–28.
4. Biologically active metabolites of Bacillus subtilis and their role in the control of phytopa-thogenic microorganisms / T.M. Sidorova [et al.] // Agricultural biology. 2018. T. 53, № 1. P. 29–37.
5. A review of the microbial production of bioactive natural products and biologics / J.V. Pham [et al.] // Frontiers in microbiology. 2019. T. 10. P. 449147.
6. Trifonova E.N. Vzaimosvyaz' tempov rosta otechestvennoj pischevoj i pererabatyvayu-schej promyshlennosti i tendencij razvitiya gosudarstvennoj denezhno-kreditnoj politiki // International agricultural journal. 2020. № 2. S. 25–35.
7. David P.R. Cryocrystallography: basic theory and methods // Practical protein crystallogra-phy, 2nd edn. Academic Press, San Diego, CA. 1999. P. 409–443.
8. Effects of lyoprotectant and encapsulated Lactobacillus acidophilus KBL409 on freeze-drying and storage stability / J. Lee [et al.] // LWT. 2023. T. 182. S. 114846.
9. Sorokina N.P., Perfil'ev G.D. Aktivnost' zakva¬sochnoj mikroflory: prichiny snizheniya i sposo¬by povysheniya. Metody predotvrascheniya porazheniya molochnokislyh bakterij bakterio¬fagami // Molochnaya promyshlennost'. 2013. № 11. S. 32–35.
10. Pegg D.E. Principles of Cryopreservation // PreservAtion of HumAn oocytes. 2009. P. 34–46.
11. Kirilenko M.A., Kuznecov O.Yu., Dmitrieva Zh.M. Vliyanie kriokonservacii na vyzhivaemost' kompleksa autoshtammov laktobakterij pri hranenii i processah biotehnologicheskogo masshtabirovaniya // Vestnik biotehnologii i fiziko-himicheskoj biologii im. Yu.A. Ovchinni¬kova. 2019. T. 15, № 2. S. 5.
12. Cryopreservation: A review article / A.N. Jais-wal [et al.] // Cureus. 2022. T. 14, №. 11.
13. Haritonova I., Prosekov A.Yu., Shramko M.I. Izuchenie kachestvennyh harakteristik koncen-tratov laktobakterij v processe kriozamorazhi-vaniya i sublimacionnoj sushki // Vestnik Severo-Kavkazskogo federal'nogo universiteta. 2015. № 2. S. 87–90.
14. Wolkers W.F., Tablin F., Crowe J.H. From anhydrobiosis to freeze-drying of eukaryotic cells // Comparative Biochemistry and Physio-logy Part A: Molecular & Integrative Physiology. 2002. T. 131, № 3. P. 535–543.
15. C18: 1 improves the freeze-drying resistance of Lactobacillus plantarum by maintaining the cell membrane / G. Wang [et al.] // ACS Applied Bio Materials. 2020. T. 3, № 8. P. 4933–4940.
16. Vliyanie dobavleniya mannozy i fukozy v zaschitnuyu sredu na fiziologicheskuyu aktiv-nost' liofilizirovannyh molochnokislyh mikroor-ganizmov / A.A. Tolkacheva [i dr.] // Aktual'-naya biotehnologiya. 2012. № 2. S. 7–11.
17. Podbor parametrov stabilizacii (zamorazhiva-nie i sushka) simbioticheskogo konsorciuma s cel'yu polucheniya zakvaski pryamogo vnese-niya / V.Yu. Krumlikov [i dr.] // Tehnika i tehno¬logiya pischevyh proizvodstv. 2016. T. 42, № 3. S. 25–30.
18. Modelirovanie kristallizacii vlagi pri zamorazhi-vanii bakterial'nyh zakvasok / E.V. Korotkaya [i dr.] // Tehnika i tehnologiya pischevyh proiz-vodstv. 2020. T. 50, № 2. S. 252–260.
19. Pojmanov V.V., Yaschenko S.M., Barykin R.A. Issledovanie processa vakuum-sublimacionnoj sushki bakterial'nyh koncentratov dlya myasnoj otrasli s ispol'zovaniem kriozamorazhivaniya // Vestnik Voronezhskogo gosudarstvennogo universiteta inzhenernyh tehnologij. 2016. № 1 (67). S. 25–30.
20. Zandanova T.N. Vybor krioprotektorov dlya zamorazhivaniya bakterial'nogo koncentrata simbioticheskoj zakvaski // Vestnik KrasGAU. 2021. № 3 (168). S. 163–168.
21. Makarenko N. Kriokonservaciya bifidobakterij // Nauka i innovacii. 2010. T. 9, № 91. S. 53–54.
22. Kriokonservaciya: perspektivnyj metod hrane-niya promyshlenno cennyh shtammov moloch-nokislyh bakterij i drozhzhej / O.A. Savkina [i dr.] // Sel'skohozyajstvennaya biologiya. 2014. № 4. S. 112–119.
23. Effect of physical properties on the stability of Lactobacillus bulgaricus in a freeze-dried galacto-oligosaccharides matrix / E.E. Tym-czyszyn [et al.] // International Journal of Food Microbiology. 2012. T. 155, № 3. P. 217–221.
24. Ohapkina V.Yu. Metody podderzhaniya mik-robnyh kul'tur. Ch. 2. Liofilizaciya // Teoreti-cheskaya i prikladnaya `ekologiya. 2009. № 4. S. 21–32.
25. Vakuumnaya sushka bakterial'nyh koncentratov i zakvasok molochnokislyh bakterij / N.`E. Kau¬hcheshvili [i dr.] // Molochnaya promyshlennost'. 2011. № 5. S. 30–31.
26. Effect of ginseng polysaccharide on the stabi-lity of lactic acid bacteria during freeze-drying process and storage / S.H. Yang [et al.] // Archives of pharmacal research. 2006. T. 29. P. 735–740.
27. Bogdanov V.D., Pankina A.V. Krioprotektory v holodil'nyh tehnologiyah produktov pitaniya // Trudy VNIRO. 2023. T. 191. S. 142–155.
28. Gracheva I.V., Osin A.V. Mehanizmy povrezh-denij bakterij pri liofilizacii i protektivnoe dejstvie zaschitnyh sred // Problemy osobo opasnyh infekcij. 2016. №. 3. S. 5–12.
29. The trehalose myth revisited: introduction to a symposium on stabilization of cells in the dry state / J.H. Crowe [et al.] // Cryobiology. 2001. T. 43, № 2. P. 89–105.
