The aim of the research is to study the presence of interspecifi migration of the pathogen of brucellosis among yaks and the specifi belonging of brucella using polymerase chain reaction. Laboratory studies were carried out using serological and classical methods of PCR analysis. The object of the study was yak farms and private farmsteads engaged in breeding yaks from the Issyk-Kul and Naryn regions, which have extensive high-mountain pastures. Blood from yaks of different sex and age was taken from a vein with a disposable needle into a sterile vacuum system of the Vacutainer type. At the fi stage, the presence of brucellosis infection in yaks was determined in the blood serum of animals using the rose-bengal test and enzyme-linked immunosorbent assay. Laboratory analysis of sera from 56 yaks indicated that in 14 cases they were infected with brucellosis. Clinical signs of disease manifestation during blood sampling did not appear. Then, positively reactive samples were examined by PCR to establish the type of Brucella. The results of laboratory tests showed that Br. Melitensis was found in the blood of infected yak, which indicated the ongoing migration of bacteria from small and large ruminants. The interspecifi migration of brucella was facilitated by the joint keeping of yaks with large and small ruminants on the common territory of farms and private households. The joint (small ruminants, large ruminants, yaks) year-round use of pastures of high-mountain natural pastures from the Naryn and Issyk-Kul regions also played an important role in the spread of brucellosis and brucella species migration. Determination of Brucella species belonging to a particular animal species will help to develop an evidence- based plan for anti-epizootic measures against brucellosis and select specifi means of prevention.
brucellosis of yaks, typing, primers, DNA (deoxyribonucleic acid), enzyme immunoassay (ELISA), rose bengal test (RBT), polymerase chain reaction (PCR).
Введение. Среди инфекционных заболева- ний бруцеллез представляет наибольшую опас- ность для здоровья человека. Болезнь, как пра- вило, протекает в хронической форме, вызывает поражение суставов и раннюю потерю трудоспо- собности.
К бруцеллезу восприимчивы все виды сель- скохозяйственных и многие виды диких живот- ных. В Кыргызстане бруцеллез среди яков диа- гностирован в 1955 г. на территории внутреннего Тянь-Шаня Нарынской и Иссык-Кульской обла- стей. Позже возбудитель бруцеллеза у яков был выявлен в южных регионах страны. Заражен- ность яков бруцеллезом в различных регионах не одинакова и колеблется от 1 до 60 %.
Как показывают наблюдения, наиболее опас- ным источником распространения бруцеллеза являются вагинальные и маточные выделения больных бруцеллезом якоматок. Они при родах инфицируют значительные участки пастбищ, являясь вторичным фактором передачи возбу- дителя бруцеллеза через травостой здоровым животным [1, 2].
Возбудитель бруцеллеза сельскохозяйствен- ных животных относится к роду Brucella, кото- рый в свою очередь подразделяется на 6 видов:
Br. abortus, Br. melitensis, Br. suis, Br. canis, Br. ovis, Br. neotomae. К возбудителям Br. abortus, Br. melitensis и Br. suis восприимчивы все виды домашних и сельскохозяйственных животных. Следовательно, эти 2 вида представляют наи- большую опасность [4, 5]. Для человека опас- ность представляет Br. melitensis (овечий вид). При этом, как установлено исследователями, Br. melitensis может мигрировать от заражен- ных овец и коз к крупному рогатому скоту [6]. В яководческих хозяйствах Таджикистана были установлены факты межвидовой миграции бру- целл от крупного рогатого скота к якам, а также регистрировались случаи выделения культуры Br. melitensis [3]. Так, С.Б. Чегировым установ- лены факты миграции возбудителя Br. melitensis от мелкого рогатого скота к крупному рогатому скоту, при этом были определены биовары 1-2-3 возбудителя [7, 8]. В последние годы в яковод- ческих хозяйствах Кыргызстана регистрируются частые случаи заражения бруцеллезом вида Br. abortus. При этом бруцеллез, вызванный видом Br. melitensis, среди яков не установлен.
Основную роль в противоэпизоотических ме- роприятиях по борьбе с бруцеллезом играет своевременное выявление фактов и путей меж-
видовой миграции возбудителя и определение видовой принадлежности возбудителя совре- менными методами.
Цель исследования: изучение наличия меж- видовой миграции возбудителя бруцеллеза сре- ди яков и видовой принадлежности бруцелл с помощью полимеразной цепной реакции.
Материалы и методы исследования. Ис- следование проводилось в Кыргызском научно- исследовательском институте ветеринарии, а также в Центре ветеринарной диагностики и экс- пертизы по северному региону. Исследования проведены с применением серологических мето- дик – роз-бенгал теста (РБТ), иммуноферментно- го анализа (ИФА) COMPELIS Akit for the diagnosis of Brucellosis фирмы «APHASCIENTIFIC» и клас- сического метода ПЦР. Постановку ПЦР анализа проводили согласно наставлению по диагности- ке бруцеллеза животных МСХ РФ от 29.09.2003 г.
№ 13-15-02/0850, а также с использованием ГОСТ КР 25385-91 «Животные сельскохозяйственные: методы диагностики бруцеллеза». В опыте было отобрано 56 яков разного пола, возраста из не- скольких яководческих хозяйств Иссык-Кульской, Нарынской областей. От них были взяты образ- цы крови и исследованы лабораторно на нали- чие бруцеллезной инфекции.
Из 56 проб, исследованных серологическими методами, 14 проб сывороток крови яков реаги- ровали положительно. Для выделения бруцелл были применены бактериологические методы исследований [4]. Для этого использовали пита-
тельные среды по культивированию на них бак- терий. Положительные пробы крови засевали на кровяной агар (по 5 мл), с добавленным антикоа- гулянтом в объеме 7 мл. Посевы выдерживали в термостате при температуре 36–37,5 °С. Инкуби- ровали в присутствии 10–15 % СО2 и в обычных атмосферных условиях. Рост культур обнаружи- вали в 8 пробах на 8-й день после засева. Биома- териалом для выделения возбудителя и поста- новки ПЦР использованы выраженные культуры. При постановке ПЦР для типизации бруцелл до вида экстрагировали нуклеиновую кислоту из выраженных культур бруцелл. В результате ко- пирования ПЦР продукта дифференцировали типовую принадлежность бруцелл.
Для типизации возбудителя бруцеллеза ис- пользовали метод ПЦР с применением набора QIAGEN «DNeasy®Blood&TissueKit». При поста- новке ПЦР анализа применяли реагенты и реак- ционные смеси фирмы Promega, а также прайме- рыфирмы«ОДОпраймтех»:универсальныйIS711 primer 5’–TGCCGATCACTTAAGGGCCTTCAT-3’,
Br. melitensis primer 5’-AAATCGCGTCCTTGCTGG TCTGA-3’, Br. abortus primer 5’-GACGAACGGAA TTTTTCCAATCCC-3’. Для учета результатов в амлификации применяли 2 % агарозный гель на 1x TAE буфере с бромистым этидием в системе BIO–RAD GelDoc XRTM.
Результаты исследования. Результаты ла- бораторных исследований на зараженность яков бруцеллезом с применением серологических ме- тодик РБТ и ИФА приведены в таблице.
Наличие положительно реагирующих проб на бруцеллез в реакциях РБТ и ИФА
|
№ п/п |
Возраст, лет |
Идентификационный номер |
РБТ |
ИФА |
ПЦР |
|||
|
проб |
% |
проб |
% |
проб |
% |
|||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
|
1 |
3 |
0397 |
– |
– |
||||
|
2 |
6 |
0373 |
– |
– |
||||
|
3 |
3 |
9960 |
+ |
+ |
||||
|
4 |
5 |
0295 |
– |
– |
||||
|
5 |
4 |
0350 |
+ |
+ |
||||
|
6 |
7 |
0447 |
+ |
+ |
+ |
|||
|
7 |
3 |
0291 |
– |
– |
||||
|
8 |
5 |
0329 |
– |
– |
||||
|
9 |
4 |
0303 |
+ |
+ |
||||
|
10 |
3 |
0293 |
+ |
+ |
||||
|
11 |
7 |
0306 |
– |
– |
||||
|
12 |
5 |
0346 |
– |
– |
||||
|
13 |
3 |
0290 |
– |
– |
||||
|
14 |
5 |
0365 |
+ |
+ |
+ |
|||
Окончание табл.
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
|
15 |
7 |
0297 |
– |
– |
||||
|
16 |
6 |
0304 |
+ |
+ |
+ |
|||
|
17 |
5 |
0324 |
– |
– |
||||
|
18 |
8 |
0435 |
+ |
+ |
+ |
|||
|
19 |
7 |
0319 |
+ |
+ |
+ |
|||
|
20 |
6 |
0448 |
+ |
+ |
+ |
|||
|
21 |
9 |
0334 |
– |
– |
||||
|
22 |
6 |
0282 |
– |
– |
||||
|
23 |
7 |
0368 |
– |
– |
||||
|
24 |
8 |
0388 |
– |
– |
||||
|
25 |
4 |
9962 |
– |
– |
||||
|
26 |
9 |
0364 |
– |
– |
||||
|
27 |
6 |
0385 |
– |
– |
||||
|
28 |
3 |
0337 |
– |
– |
||||
|
29 |
6 |
0433 |
+ |
+ |
+ |
|||
|
30 |
5 |
– |
+ |
+ |
+ |
|||
|
31 |
7 |
– |
– |
– |
||||
|
32 |
6 |
0285 |
– |
– |
||||
|
33 |
4 |
– |
– |
– |
||||
|
34 |
4 |
– |
– |
– |
||||
|
35 |
6 |
– |
– |
– |
||||
|
36 |
4 |
0331 |
– |
– |
||||
|
37 |
9 |
0325 |
– |
– |
||||
|
38 |
4 |
0413 |
– |
– |
||||
|
39 |
7 |
0323 |
+ |
+ |
||||
|
40 |
8 |
0398 |
+ |
+ |
||||
|
41 |
2 |
– |
– |
– |
||||
|
42 |
1 |
– |
– |
– |
||||
|
43 |
3 |
– |
– |
– |
||||
|
44 |
2 |
0281 |
– |
– |
||||
|
45 |
2 |
0333 |
– |
– |
||||
|
46 |
2 |
– |
– |
– |
||||
|
47 |
3 |
– |
– |
– |
||||
|
48 |
1 |
0430 |
– |
– |
||||
|
49 |
1 |
0432 |
– |
– |
||||
|
50 |
6 |
0353 |
– |
– |
||||
|
51 |
1 |
– |
– |
– |
||||
|
52 |
1 |
– |
– |
– |
||||
|
53 |
2 |
– |
– |
– |
||||
|
54 |
4 |
– |
– |
– |
||||
|
55 |
1 |
– |
– |
– |
||||
|
56 |
1 |
– |
– |
– |
||||
|
Всего 56 проб |
14 |
25 |
14 |
25 |
8 |
14 |
||
Как следует из данных таблицы, из 56 иссле- дованных образцов сыворотки крови положитель- но на бруцеллез реагировали 14 проб, т. е. 25 % от числа исследованных. А в реакции ПЦР из 14 положительных проб только в 8 пробах выявлены бруцеллы, т. е. 14 % от общего числа исследован- ных проб. В среднем зараженность яководческих
ферм, где проводились наблюдения, была в пре- делах 10–15 %. В связи с отсутствием профилак- тических мероприятий зараженность яков бруцел- лезом имеет тенденцию роста.
При типизации бруцелл ПЦР были обнаруже- ны специфические полосы на уровне 498 п.н. и одна проба на уровне 731 п.н. (рис.).
Результаты амплификации образцов
В 2 % агарозном геле обнаружены фрагмен- ты ДНК бактерии Br. abortus на уровне 498 п.н. и Br. melitensis на уровне 731 п.н.
В результате применения высокочувстви- тельного ПЦР анализа было установлено, что бруцеллез у 7 исследованных яков был вызван возбудителем Br. abortus и у одного Br. melitensis. Лабораторные исследования и проведенные на- блюдения показали, что миграция возбудителя Br. melitensis среди яков происходила в резуль- тате их контакта с инфицированным крупным и мелким рогатым скотом при совместном их со- держании на общих естественных пастбищах.
Выводы. Результаты наблюдений и лабо- раторных исследований показали, что распро- странение бруцеллеза среди яков происходит в большинстве случаев во время случек и отела якоматок. Межвидовая миграция возбудителя
бруцеллеза вида Br. melitensis среди яков, овец и крупного рогатого скота происходит в резуль- тате совместного их содержания на сезонных естественных пастбищах. Немаловажное место в распространении бруцеллеза занимает зара- жение пастбищного травостоя аборт плодами инфицированных якоматок.
Проведенные лабораторные исследования подтвердили вероятность миграции бруцелл ви- дов Br. abortus и Br. melitensis среди яков, о чем сообщалось другими исследователями. ПЦР диагностика по идентификации видов бруцелл является преобладающим методом установле- ния путей миграции возбудителя бруцеллеза и выбора средств и методов мер борьбы с бруцел- лезной инфекцией.
1. Kim V.I. Vklad kyrgyzskih uchenyh v izuche- nie brucelleza zhivotnyh. Kara-Balta, 2004. S. 140–143.
2. Belyakov A.I. Materialy po izucheniyu bru- celleza yakov v Kirgizskoy SSR: avtoref. dis. … kand. veterinar. nauk. Frunze, 1971. S. 5–7.
3. Taranov V.A. Materialy po izucheniyu bru- celleza sel'skohozyaystvennyh zhivotnyh v Tadzhikistane za 20 let i bakteriologiche- skaya, seroallergicheskaya diagnostika bru- celleza u yakov: avtoref. dis. ... kand. vete- rinar. nauk. Frunze, 1971. S. 13–14.
4. Trilenko P.A. Brucellez sel'skohozyaystven- nyh zhivotnyh. M.: Kolos, 1976. S. 256–257.
5. Sklyarov O.D. Molekulyarnye mehanizmy genotipirovaniya patogenov // Sb. nauch. tr. VGNKI. M., 2003. S. 64.
6. Fedorov N.A., Suhanov Yu.S., Asadi Mobar- han A.H. i dr. Polimeraznaya cepnaya reakciya (PCR): metod. posobie. M., 1996. S. 33.
7. Zhovanik P.N., Demchenko A.V., Bozhko G.K., Ko- rotich A.S. Brucellez. Kiev: Urozhay, 1975. S. 9.
8. Chegirov S.B. Molekulyarno-biologicheskaya harakteristika brucelly melitenzis i bru- celly abortus v Kyrgyzstane: dis. … kand. biol. nauk: 06.02.02. Bishkek, 2015. S. 68–71.
