Russian Federation
Russian Federation
The aim of the study is to assess the level and intensity of ROS production in the peripheral blood of farm animals under conditions of a low-dose radiation load. The study was carried out on lactating cows (black-and-white and red-and-white breed). In the village of Momotovo, 20 blood samples were examined (the average age of the animals was 71 ± 14 months); in the village of B. Balchug – 11 samples (the average age of the animals is 60 months), in the village of Borsk – 20 blood samples (the average age of the animals is 72 ± 6 months).It was found that datum of lactating cows under the influence of low doses of ionizing radiation (1.3 and 1.6 mGy/year) and under the action of background values (0.9 mGy/year) did not differ statistically: ESR, the number of erythrocytes, leukocytes and their phagocytic activity. The total amount of primary radicals spontaneously generated in the blood of cattle under the influence of a radiation dose of 1.3 and 1.6 mGy/year is significantly higher, and the secondary radicals formed during antigenic activation in vitro are significantly lower than in animals when exposed to a radiation dose of 0.9 mGy/year. The activation index of the generation of luminol- and lucigenin-dependent ROS in cattle from the territory with an irradi- ation dose of 1.3 mGy/year is 1.4 times less than in animals under the action of a dose of 0.9 mGy/year; it indicates a reduction in stand-by capacity of neutrophils to the active forms of oxygen generation. On the basis of the results it may be concluded, that under the impact of 1.3 and 1.6 mGy/year radiation doses, the total number of spontaneous primary radicals in peripheral blood of lactating cows significantly increases; the total number of secondary radicals generated by antigen-activated cells decreases.
phagocytic activity of leukocytes, peripheral blood, chemiluminescence, reactive oxygen species, free radicals.
Введение. Ионизирующее излучение от техногенных радионуклидов, находящихся в экосистеме, входит в перечень факторов, ока- зывающих негативное действие на человека и биологические объекты. На территории РФ есть регионы с напряженной радиационной ситуа- цией, это определяется размещением радиаци- онно опасных объектов, Красноярский край отно- сится к таким территориям. На основе сведений ежегодного мониторинга радиационной ситуации на большей части Красноярского края радиа- ционная обстановка оценивается как благопо- лучная. На территории края выявлено очаговое, точечное загрязнение поймы р. Енисей антро- погенными радионуклидами, загрязнение было сформировано в результате деятельности ФГУП
«Горно-химический комбинат». Установленное
техногенное загрязнение точечное, имеет раз- личный радионуклидный состав, оно регистриру- ется в р. Енисей на всем протяжении от Горно- химического комбината до Карского моря [1].
Вопросам оценки миграционной способности техногенных радионуклидов между компонента- ми биосистем, моделированию ее активности на загрязненных территориях в настоящее время уделяется значительное внимание радиоэколо- гов. На многих загрязненных территориях деталь- но изучена миграционная активность основных дозообразующих техногенных радионуклидов [2, 3]. При инкорпорировании и накоплении ра- дионуклидов в биологических объектах разного уровня трофической цепи создается опасность их повреждения в результате внутреннего облу-
чения даже при уровне загрязнения среды ниже допустимого, но выше фонового.
Ионизирующее излучение, даже в малых дозах, активно действует на гемопоэтическую ткань, изменяет биохимические показатели крови у сельскохозяйственных животных [4]. У коров, содержащихся в условиях низкодозо- вого облучения, выявлено увеличение фагоци- тарного индекса нейтрофилов периферической крови [5]. Установлено, что процессы генера- ции активных форм кислорода (АФК) клетками организма являются чувствительными к воздей- ствию незначительных доз радиации [6]. Про- цесс формирования АФК клетками организма в ответ на антигенное внедрение in vitro, фикси- руемый хемилюминесцентным методом в кро- ви, отражает динамичность функционирования каскадно-действующих про- и антиоксидантных ферментов клеточных клеток крови [7, 8]. В связи с недостаточностью знаний о механизмах воз- действия низкоинтенсивной радиации сущест- вуют трудности с прогнозированием результатов этих воздействий на организмы, преодолением их негативных последствий и использованием их положительных результатов.
Цель исследования: определение уровня и интенсивности продукции АФК в периферической крови лактирующих коров при воздействии низких поглощенных доз ионизирующего излучения.
Материалы и методика исследования. Ис- следование было проведено в 2018–2020 гг. в среде агробиоценозов трех населенных пунктов Красноярского края. Населенные пункты имеют различный радиоэкологический статус, с. Б. Бал- чуг и с. Момотово территориально принадлежат ЗН ФГУП ГХК, в агробиоценозах, расположенных на берегу р. Енисей, этих населенных пунктов выявлены участки с дополнительной техноген- ной нагрузкой. Поселок Борск являлся контроль- ным, почвы и вода этого пункта не имеют допол- нительного техногенного загрязнения.
В периоды санитарно-ветеринарного обсле- дования у лактирующих коров черно-пестрой и красно-пестрой пород были отобраны пробы пери- ферической крови. В п. Момотово было исследо- вано 20 проб крови (средний возраст животных – 71±14 мес.), в с. Б. Балчуг – 11 проб (средний возраст животных – 60 мес.), животные принад- лежали частным владельцам. В п. Борск исследо- вано 20 проб крови (средний возраст животных – 72±6 мес.), животные принадлежали ООО «Мин- дерлинское». Населенные пункты и ООО «Миндер- линское» являются благополучными по заразным заболеваниям, животные соматически здоровы.
Анализ гематологических показателей выполнял- ся по общепринятым методикам [9]. Фагоцитарную активность клеток венозной крови исследовали че- рез 3 ч после антигенной активации in vitro части- цами латекса, опсонизированными белками пуло- вой сыворотки крови крупного рогатого скота, при окраске 0,25 % генцианвиолетом в 3 % растворе уксусной кислоты по окончании фиксации хемилю- минесцентным способом по методу В.М. Земскова образования первичных и вторичных радикалов клетками венозной крови [8]. Хемилюминесцентная кинетика спонтанной и активированной генерации первичных и вторичных радикалов определялась на «Хемилюминометр 3604-ПЭВМ». Для усиления люминесценции применяли люцигенин и люминол, которые обладают селективностью к первичным и вторичным радикалам кислорода соответственно. Регистрация хемилюминесцентной кривой прово- дилась в течение 3 ч, при температуре +38 °С. Для сравнительного анализа использовали основные параметры хемилюминесцентной кинетики гене- рации АФК: время достижения максимума (Tmax, мин); амплитуду пиков генерации АФК (Imax, имп/с); светосумму под хемилюминесцентной кривой (S, имп/180 мин); индекс активации (ИА = Sакт/Sспонт, усл. ед.).
Дозы облучения лактирующих коров рас- считывали согласно ветеринарным правилам 13.73.13/12-00 «Оценка доз облучения сельско- хозяйственных животных на территории, загряз- ненной радионуклидами». Для статистической обработки полученных данных использовали методы вариационной статистики: критерий Манна-Уитни, t-критерий Стьюдента на базе про- грамм MS Office Excel 2007. Достоверные отли- чия параметров хемилюминисценции считали достоверными при Р ≤ 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение. В результате определения поглощенных доз уста- новлено, что суммарная поглощенная доза воз- действия (внешнее и внутреннее облучение) у мо- лочных коров в с. Б. Балчуг составила 1,6 мГр/год, в с. Момотово – 1,3 мГр/год, в п. Борск – 0,9 мГр/год. В п. Борск величина поглощенной дозы находилась в пределах значений, характеризующих глобаль- ный техногенный фон, который регистрируется на всей территории Красноярского края. В результате расчета выявлено, что доза облучения лактирую- щих коров в с. Момотово в 1,5 раза, с. Б. Балчуге в 1,7 раза выше, чем в п. Борске. Полученные значе- ния поглощенных доз принадлежат диапазону низ- ких доз, согласно рекомендации научного комитета по атомной энергии при ООН.
На основании гематологического анализа пе- риферической крови выявлено, что СОЭ, количе- ство форменных элементов крови у лактирующих коров при дозах 1,6; 1,3 и 0,9 мГр/год находятся в одном диапазоне изменчивости, соответственно не отличаются. Фагоцитарный индекс лейкоци- тов крови коров при дозе 0,9 мГр/год составил 36,6±1,5 %, при дозе 1,3 мГр/год – 37,8±2,3 %, при воздействии 1,6 мГр/год – 43,6±2,5 %. Полу- ченные данные принадлежат одному диапазону изменчивости, соответственно статистически не отличаются.
Хемилюминесцентная кинетика генерации первичных и вторичных АФК клетками венозной крови у лактирующих коров характеризовалась двумя максимумами и имела специфические особенности для крови животных с территорий с различной дозовой нагрузкой.
Значения времени достижения максимумов генерации первичных АФК клетками крови у мле- копитающих, находящихся под воздействием доз облучения 1,3; 1,6 и 0,9 мГр/год, достоверно не отличались. У всех животных величина време- ни достижения первого максимума спонтанной продукции люцигенинзависимых радикалов в среднем регистрировалась на 22-й мин, второго максимума – на 132-й мин. При антигенной ак- тивации in vitro клеток крови частицами опсони- зированного латекса выход кинетики генерации люцигенинзависимых АФК на первый максимум регистрировался в среднем к 23-й мин, второй максимум достигался на 139-й мин.
Первый максимум интенсивности спонтанной генерации вторичных АФК у всех животных не-
зависимо от дозы облучения регистрировался на 18,6-й мин. Значение времени достижения вто- рого максимума интенсивности генерации вто- ричных радикалов у крупного рогатого скота при воздействии доз 1,6 и 0,9 мГр/год находилось в одном диапазоне изменчивости и в среднем со- ставляло 169 мин. У крупного рогатого скота при дозе 1,3 мГр/год выявлено достоверное (критерий Стьюдента Р < 0,01) сокращение времени фор- мирования второго максимума кинетики спон- танной генерации люминолзависимых АФК до 138,1±6,5 мин. При активации клеток крови in vitro частицами латекса самое короткое время образования первого максимума хемилюминес- центной кинетики генерации люминолзависимых АФК (17,4±2,2 мин) было выявлено у коров при дозе 0,9 мГр/год. У крупного рогатого скота при воздействии доз облучения 1,3 и 1,6 мГр/год на- блюдалась достоверная (P < 0,01) задержка на 7,5±1,5 мин выхода на первый пик хемилюминес- центной кривой. Время достижения второго пика хемилюминесцентной кривой генерации вторич- ных люминолзависимых АФК антигенактивиро- ванными клетками не зависело от дозы облучения и в среднем регистрировалось на 135 мин.
При оценке амплитуды первого максимума интенсивности генерации (Imax(I), имп./с) пер- вичных радикалов было установлено, что ее значение при спонтанной и активированной ге- нерации АФК в крови у животных достоверно не изменяется (рис. 1). Но для антигенактивирован- ной продукции АФК проявляется тенденция сни- жения величины максимума с увеличением дозы облучения.
Рис. 1. Амплитуда первого максимума хемилюминесцентной кинетики генерации первичных АФК
При увеличении дозы облучения отмеча- лось увеличение амплитуды второго максимума (Imax(II), имп/с) кинетики спонтанной и активиро- ванной генерации первичных АФК в крови (табл.), особенно ярко это проявлялось при спонтанной
генерации АФК. У лактирующих коров при погло- щенной дозе в 0,9 мГр/год значения амплитуды второго максимума кинетики спонтанной и анти- генактивированной генерации АФК совпадали.
Амплитуда второго максимума хемилюминесцентной кинетики генерации люцигенинзависимых АФК
|
Доза облучения, мГр/год |
Imax(II), имп/с |
|
|
Спонтанная генерация |
Активированная генерация |
|
|
0,9 |
919,4±138,3 |
913,2±102,53 |
|
1,3 |
1383,0±252,1 |
824,7±85,6 * |
|
1,6 |
1582,0±284,3 |
1355,7±215,8 |
*Р < 0,05.
Особенность изменения кинетики генера- ции люцигенинзависимых АФК при антигенной стимуляции клеток крови частицами латекса от- носительно кинетики их спонтанной продукции выражалась в снижении величины и первого, и второго максимума, наиболее ярко выражена у животных, находящихся под воздействием дозы облучения в 1,6 мГр/год (Р < 0,05).
Амплитуда первого максимума (Imax(I), имп/с) спонтанного образования вторичных ра- дикалов у лактирующих коров, находящихся под
воздействием доз 1,3 и 1,6 мГр/год, была до- стоверно ниже (критерий Стьюдента – Р < 0,05, критерий Манна-Уитни – Р < 0,01) по сравнению с данными, полученными при воздействии дозы 0,9 мГр/год. Активация частицами латекса об- уславливает увеличение генерации вторичных радикалов, наиболее ярко этот процесс про- текает у животных при воздействии дозы в 0,9 и 1,6 мГр/год (рис. 2), критерий Манна-Уитни для поглощенной дозы 1,3 мГр/год составил Р < 0,01, для дозы в 1,6 мГр/год – Р < 0,01.
Рис. 2. Амплитуда первого максимума (Imax(I)) хемилюминесцентной кинетики генерации люминолзависимых АФК
Значение амплитуды второго максимума об- разования (Imax(II), имп/с) спонтанных и активи- рованных вторичных активных форм кислорода (люминолзависимых) у лактирующих коров не имела зависимости от значений поглощенной дозы облучения.
Суммарное количество спонтанно генерирую- щихся первичных радикалов в периферической крови молочных коров при поглощенных дозах в
1,6 и 1,3 мГр/год значимо (Р < 0,05 по Стьюденту) выше, чем при воздействии поглощенной дозы в 0,9 мГр/год (рис. 3). При инициации фагоцитар- ной активности клеток крови введением частиц латекса суммарная продукция АФК в крови у животных под воздействием дозы в 0,9 мГр/год возрастает в 1,26 раза, тогда как у животных под воздействием доз 1,3 и 1,6 мГр/год наблюдается угнетение образования АФК.
Рис. 3. Светосумма первичных радикалов при спонтанном и антигенактивированном образовании АФК
Суммарное число спонтанно генерирующихся вторичных активных форм кислорода, форми- рующихся в венозной крови при дозах 0,9; 1,3 и 1,6 мГр/год статистически не отличаются. При воздействии антигена в условиях in vitro в веноз- ной крови регистрируется увеличение продукции вторичных радикалов, наиболее ярко это наблю- дается при дозе 0,9 мГр/год (увеличение на 4,1 раза). Увеличение продукции вторичных радика- лов в ответ на антигенное воздействие являет- ся физиологичным процессом. У животных при
действии доз 1,3 и 1,6 мГр/год увеличение АФК менее выражено, при этих дозах рост АФК соста- вил 1,9 и 3,6 раза соответственно. Суммарный объем вторичных антигенактивированных ради- калов, образующихся в периферической крови при дозах 1,3 и 1,6 мГр/год, достоверно (крите- рий Стьюдента – Р < 0,01) ниже, чем у животных при дозе 0,9 мГр/год (рис. 4), что указывает на снижение реактивной способности клеток веноз- ной крови.
Рис 4. Светосумма вторичных радикалов при спонтанном и антигенактивированном образовании АФК
На основе данных по суммарному объему образованных за 3 ч в венозной крови крупного рогатого скота первичных, вторичных радика- лов при спонтанной и антигенактивированной генерации было определено значение индекса
активации процесса хемилюминесценции, ин- декс показывает реактивную способность клеток периферической крови организма к продукции свободных радикалов в ответ на внедрение ан- тигена (рис. 5).
Рис 5. Индекс активации генерации АФК клетками периферической крови крупного рогатого скота
При воздействии поглощенных доз в значе- ниях 0,9; 1,3 и 1,6 мГр/год индекс активации генерации первичных и вторичных радикалов принадлежит одному диапазону изменчивости. Однако установлена тенденция к снижению ин- декса активации люминолзависимых радикалов. При действии малого ионизирующего излуче- ния в диапазоне низких доз – 1,3 и 1,6 мГр/год у крупного рогатого скота в венозной крови вы- явлены отличия хемилюминесцентной кинетики генерации АФК, которая интегрально отражает кинетику последовательной активации про- и ан- тиоксидантных составляющих системы крови при антигенной активации и без нее. При малых раз- ведениях крови первый максимум характеризует кинетику респираторного взрыва при активации фагоцитирующих клеток крови опсонизирован- ными частицами латекса (адгезия, поглощения частиц латекса), а без антигенной активации – реакцию фагоцитирующих клеток на собствен- ные, «деформированные» молекулярные струк- туры при инкубации крови вне организма. Второй пик антигенстимулированной генерации АФК обусловлен эндогенной активацией «резервных» нейтрофилов [10, 11], а также образованием ли-
пидных и белковых пероксидов [7].
Кинетика спонтанной генерации первичных люцигенинзависимых радикалов в крови жи- вотных под воздействием доз 1,3 и 1,6 мГр/год по интегральному объему АФК (S) достоверно превышала показатели животных при действии дозы 0,9 мГр/год. Антигенная активация клеток крови in vivo сопровождалась снижением гене- рации люцигенинзависимых АФК у животных при действии доз 1,3 и 1,6 мГр/год, тогда как у живот- ных при дозе 0,9 мГр/год сохранялась на том же уровне.
Повышение дозы облучения сопровождалось увеличением продукции свободных радикалов, не связанной с процессом фагоцитоза эндоген- ного антигена, это ярко выражено для животных с дозой облучения 1,6 мГр/год. Очевидно, это следствие истощения компонентов антиокси- дантной активности венозной крови.
Суммарное число первичных АФК, спонтанно образующихся в крови лактирующих коров под воздействием дозы облучения в 1,3 и 1,6 мГр/год, достоверно (критерий Стьюдента – Р < 0,05) выше, а вторичных, образованных при антигенной акти- вации in vitro, достоверно (критерий Стьюдента – Р < 0,01) ниже, чем у коров при поглощенной дозе 0,9 мГр/год.
Индекс активации образования первичных и вторичных АФК у крупного рогатого скота с территории с дозой облучения в 1,3 мГр/год в 1,4 раза меньше, чем у животных при действии дозы 0,9мГр/год, что указывает на снижение ре- зервных возможностей нейтрофилов к генерации АФК.
Увеличение значения ИА генерации вторич- ных радикалов при дозе облучения в 1,6 мГр/год связано либо с резким увеличением продукции липидных перекисных радикалов, либо с присут- ствием «незрелых» нейтрофилов [10, 11], либо с недостаточной активностью антиоксидантной си- стемы клеток и плазмы крови, под контролем ко- торой находится образование липоперекисей [7]. Выводы. В результате исследования выявле- но, что у крупного рогатого скота при поглощенных дозах 1,3 и 1,6 мГр/год и при дозе 0,9 мГр/год стати- стически не отличаются: СОЭ, количество эритро- цитов, лейкоцитов и их фагоцитарная активность. У крупного рогатого скота, находящегося под воз- действием доз облучения в 1,3 и 1,6 мГр/год, выяв- лено снижение суммарного количества вторичных АФК, генерируемых анигенактивированными клет- ками, и увеличение суммарного количества спон-
танно генерируемых первичных АФК.
Из выявленных закономерностей следует, что у крупного рогатого скота процессы генерации активных форм кислорода, играющие ведущую роль в противомикробном и противоопухолевом иммунитете иммунокомпетентными клетками в процессе функционирования (например фа- гоцитоз) и регулируемые активностью про- и антиоксидантных систем организма, являются чувствительными к воздействию слабых доз ио- низирующего излучения.
1. Atlas csovremennoy radiacionnoy obsta- novki na territorii Krasnoyarskogo kraya / M-vo ekologii i racional'nogo prirodo- pol'zovaniya Krasnoyarskogo kraya. Krasno- yarsk, 2019. 84 s.
2. Simon S.L., Graham J.C., Terp S.D. Uptake of 40K and 137Cs in native plants of the Marshall Islands // Journal of Environmental Radioactivity. 2002. Vol. 59. P. 223–243.
3. Fedotova A.S. Migracionnaya sposobnost' tehnogennyh radionuklidov v agrobioceno- zah lesostepnoy zony Krasnoyarskogo kraya / Krasnoyar. gos. agrarn. un-t. Krasnoyarsk, 2017. 138 s.
4. Kruglikov B.P. i dr. Fiziologicheskoe so- stoyanie i produktivnye kachestva sel'sko- hozyaystvennyh zhivotnyh, dlitel'no soder- zhaschihsya na zagryaznennoy radionuklidami territorii // Sb. dokl. Pervoy Vsesoyuznoy konf. Yadernogo obschestva SSSR (g. Obninsk, 26–29 iyunya 1990 g.). M., 1990. T. 2. S. 96–98.
5. Miheeva E.A. Vliyanie malyh doz ioniziru- yuschego izlucheniya na pokazateli krovi krup- nogo rogatogo skota // Zootehniya. 2006. № 7. S. 24–26.
6. Protas A.F. Aktivnost' antioksidantnyh fermentov i uroven' svobodnoradikal'nyh processov v yadrah kletok neyronov pri niz- kih dozah oblucheniya // Biopolimery i klet- ka. 1996. T. 12, № 3. S. 47–53.
7. Vladimirov Yu.A., Proskurnina E.V. Free radicals and cell chemiluminescence // Biochemistry (Moscow). 2009. Vol. 74, № 13. P. 1545–1566.
8. Zemskov V.M., Barsukov A.A., Gnatenko D.A. i dr. Fundamental'nye i prikladnye aspek- ty analiza kislorodnogo metabolizma fago- citarnyh kletok // Uspehi sovremennoy bio- logii. 2013. T. 133, № 5. S. 469–480.
9. Smolin S.G. Fiziologiya sistemy krovi: metod. ukazaniya / Krasnoyar. gos. agrar. un-t. Krasnoyarsk, 2007. 48 s.
10. Gerasimov I.G., Ignatov D.Yu. Svertyvanie krovi aktiviruet neytrofily k respirator- nomu vzryvu // Byulleten' eksperimental'- noy biologii i mediciny. 2005. T. 140, № 7. S. 88–90.
11. Fedorov G.N., Leonov S.D. Osobennosti he- milyuminescencii cel'noy razvedennoy krovi // Matematicheskaya morfologiya. 2007. T. 6, vyp. 4. URL: http://www.smolensk.ru/user/ sgma/MMORPH/N-16-html/cont.htm (data ob- rascheniya: 14.01.2013).
