Введение. Овес посевной (Avena sativa L.) – зерновая культура, широко используемая как корм для животных и птицы, а в последнее время приобретающая все большую популярность и в питании человека. Зерно овса обладает сбалансированным аминокислотным составом, богато жирными кислотами и β-глюканами, благодаря чему широко используется в диетическом и функциональном питании [1, 2].Большое влияние на производство этой культуры оказывает возбудитель корончатой ржавчины овса – Puccinia coronata Corda f. sp. avenae Erikss. Это заболевание приводит к снижению урожайности зерна до 20 % и более, а также ухудшает качество получаемой крупы. Защита от данного паразита требует комплексного подхода, включающего удаление альтернативных хозяев рода Rhamnus L., которые способствуют не только размножению патогена, но и эволюции новых рас; внесение прикорневых фунгицидов и создание сортов с генетической устойчивостью к патогену [3, 4].У овса идентифицировано более 100 генов устойчивости к корончатой ржавчине [5]. В качестве доноров генов расоспецифической устойчивости широко используют дикие популяции A. sterilis L., от которых интрогрессирована почти половина из описанных генов: Pc35, Pc36, Pc38-77, Pc97, Pc98, Pc101, Pc103, Pc104. Кроме того, источниками генов устойчивости выступают такие виды, как A. magna Murphy et Terr., A. strigosa Schreb., A. longiglumis Durieu, A. murphyi Ladiz, A. barbata Pott. ex Link [3, 4].Значительно повысить эффективность селекционного процесса, в том числе и на устойчивость к заболеваниям, позволяют методы молекулярного маркирования. Маркер-ассоциированная селекция (marker-assisted selection) основывается на применении ДНК-маркеров, сцепленных с целевым геном или локусом [6, 7]. Овес в генетическом плане изучен меньше, чем пшеница и ячмень. Как отмечает А.В. Бакулина с соавт., несмотря на большое разнообразие описанных в литературе генов Pc, лишь для небольшого числа из них определена хромосомная локализация и указаны сцепленные ДНК-маркеры [3]. Эффективность ДНК-маркера на конкретной картирующей популяции не означает, что он будет также эффективен на другом селекционном материале [8].Цель исследований – оценка эффективности некоторых праймеров к высокоэффективным генам устойчивости к корончатой ржавчине с использованием генетической коллекции овса сибирской селекции.Материалы и методы. Исследования проводили на базе лаборатории геномных исследований в растениеводстве Тюменского научного центра СО РАН в 2022 г. Материалом для исследования послужили селекционные линии и сорта овса посевного селекции НИИСХ Северного Зауралья – филиала ТюмНЦ СО РАН, а также сорта – источники высокоэффективных генов устойчивости к корончатой ржавчине из коллекции Федерального исследовательского центра «Всероссийский институт генетических ресурсов растений имени Н.И. Вавилова» (ВИР). В качестве отрицательного контроля использовались восприимчивые к корончатой ржавчине сорта овса – Neklan и Kasztan (табл. 1).На основе литературных источников были подобраны праймеры к высокоэффективным генам устойчивости к корончатой ржавчине овса (табл. 2) [9].  Таблица 1Анализ образцов овса посевного № п/пШифрСорт / линияГен Pc№ п/пШифрСорт / линия1В1РС 38Pc 3818С5Тоболяк2В2Нарпс (РС 39)Pc 3919С6Радужный3В3Гибрид (к-15020)Pc 3820С7Сириус4В4Гибрид (к-15021)Pc 3921С8ТМ 07-95-165В5AC GoslinPc 4822С9ТМ 11-6-16В6КамбулинскийPc 4823С10ТМ 11-417В7РС 68Pc 6824С1114-67-38В8AC FrancisPc 6825С1214-50-309В9PC 58Pc 5826С1316-58-1010В10AC MedalionPc 38, 39, 6827С1416-46-911В11Astor 28С1516-33-1112В12NeklanВосприимчивый29С1616-67-213В13KasztanВосприимчивый30С1716-8-1914С1Мегион 31С1816-58-415С2Талисман 32С1916-43-1516С3Отрада 33С2016-46-1617С4Фома    Примечание: В1–В13 – образцы, предоставленные из коллекции ВИР, С1–С20 – образцы из коллекции НИИСХ Северного Зауралья. Таблица 2Праймеры к генам Pc, использованные для оценки коллекции овса посевного Ген / ПраймерПоследовательность12Pc38GMI_ES17_c4223_141F-GATGCCCAAGCACTTCTCCR-GAAGAAGGTACAATGATAGGAGCTGPc38 GMI_DS_LB_459F-GTCTGAGCAGCTAGGGATCGR-TGCCCAAGTTCAGTTCAGTGРс38Xcdo673F-GCCATTGGTATTGCGAGAGGR-ACGAGCGTCAGTCGGTCACTPc48GMI_ES01_c10310_366F- CTGGTACGACCGTTCTGTCAR- CCTTCTTCGATCATCGGCTA Окончание табл. 212Pc48GMI_ES_LB_9185F-CATCTCTGGATTTGAGGGTGAR-CTTGGGCTCATTGATCTGGTPc68GMI_DS_LB_8147F- GGCACCATACGAGGTAGTTTATGR- TGTGGGTAGATTTTTGTGACCAPc68GMI_ES02_c11450_462F-GGGCGATTTCTTGTAGTGGAR-TCTCAGATGGTGAGGTTAGTATCGPc68GMI_DS_A3_340_378F-AAAGTGGCAACAAAGGGATGACR-GCGGTATTTTGATCTGATTTGCPc71GMI_ES01_c3435_183F- CAAGCTCTGTGAAGATGTTGCR- AAAGCGACGAATTTCAAGCAPc71GMI_ES15_c14779_89F-GATACTACAGACGAGGCATCCAR-CAAGATCACAACTGGCCTCA  Дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) для исследований выделяли из 5-дневных проростков с помощью набора для выделения «ЦитоСорб», Синтол. Для подбора условий полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали концентрированную и разведенную в 10 раз ДНК.При подборе оптимальных условий амплификации применяли несколько реакционных смесей (табл. 3).  Таблица 3Состав смесей для амплификации, мкл ПоказательСмесь 1Смесь 2Смесь 3Смесь 410×буфер2,52,02,52,0MgCl21,52,01,50,8dNTP2,00,51,01,6primerF0,60,251,50,5primerR0,60,251,50,5Taq.Polymerase0,20,50,50,2H2O15,613,59,012,4ДНК2,01,02,52,0Объем 1 образца, мкл25,020,020,020,0  Разделение фрагментов амплификации проводили в 2 % агарозном и 8 % полиакриламидном гелях (ПААГ). В состав ПААГ входили: акриламид 30 % – 13,3 мл; вода бидистиллированная – 26,4 мл; персульфат аммония 3 % – 4 мл; буфер 5×ТВЕ (маточный раствор трис-борат-ЭДТА (Tris-Borat-EDTA)) – 10 мл; ТЕМЕД (тетраметилэтилендиамин)– 15 мкл. Для проведения амплификации использовали несколько режимов (табл. 4).  Таблица 4Использованные режимы амплификации РежимЭтапТемпература, °СДлительностьКоличество циклов123451Денатурация943 мин45 9430 сОтжиг361 минЭлонгация722 минОкончание табл. 4123452Денатурация982 мин35 9815 сОтжиг5615 сЭлонгация7215 с 725 мин3Денатурация953 мин34 9530 сОтжиг6030 сЭлонгация721 мин 725 мин  Результаты и их обсуждение. На начальном этапе для проведения ПЦР использовали только ДНК сортов-источников генов Pc с целью увидеть продукт амплификации, свидетельствующий о наличии целевого гена в сортах-донорах. На электрофореграммах восприимчивых сортов, выступающих в качестве отрицательного контроля, целевой фрагмент должен был отсутствовать.Важным этапом в повышении чувствительности и специфичности ПЦР является правильный подбор концентрации ионов магния и температуры плавления/отжига праймеров [10–13]. В настоящее время существует большой выбор программного обеспечения для расчетов теоретических величин данных показателей, но зачастую подбирать оптимальные условия амплификации приходится эмпирическим путем. В нашем случае для подбора наиболее подходящих условий для каждого из праймеров были использованы различные буферные смеси и режимы амплификации.В результате проведения амплификации со смесями 1 и 2 при режиме 1 четких отличий между образцами, имеющими в своем генотипе целевой ген, и образцами без него не выявлено (рис.1).    Рис. 1. Продукты амплификации, полученные при использовании ДНК образцов В1–В13 и смеси 2, режим амплификации 1. 1–13 – порядковые номера образцов В1–В13. Подписи на рисунке обозначают ген устойчивости и используемый праймер, :10 – ДНК в 10-кратном разведении  Для оптимизации режима амплификации была рассчитана приблизительная температура плавления праймеров по формуле Tm (°C) = 2×(nA+nT)+4×(nG+nC),где nA – количество нуклеотидов аденина; nT – количество нуклеотидов тимина; nG – количество нуклеотидов гуанина; nC – количество нуклеотидов цитозина в праймере [14]. Исходя из полученных значений, был модифицирован режим амплификации. Для праймеров GMI_ES17_c4223_141, GMI_ES01_c10310_366 и GMI_DS_LB_8147 Тm составила 56,5 °С, GMI_DS_A3_340_378 – 58,0 °С, время отжига – 30 с. Остальные значения режима амплификации остались прежними. Использовали смеси 1 и 2. Разделение фрагментов амплификации проводили в 2 % агарозном геле и 8 % ПААГ.   Рис. 2. Продукты амплификации, полученные при использовании ДНК образцов В1–В13, смеси 2, Тm = 56,5 °С. Гель – ПААГ 8 %. 1–13 – порядковые номера образцов В1–В13. Подписи на рисунке обозначают ген устойчивости и используемый праймер  Благодаря более высокой разрешающей способности полиакриламидного геля по сравнению с агарозным разделение продуктов амплификации в 8 %-м ПААГ позволило отличить несколько фрагментов с близкой молекулярной массой. Однако эти бэнды также были характерны для всей выборки образцов.Как отмечают П.С. Новиков с соавт. (2011), оптимальная температура плавления праймера может отличаться от теоретически рассчитанной. Например, на значение этой величины могут оказывать влияние соседние азотистые основания, участвующие в стэкинг-взаимодействиях [13]. При этом, подбирая оптимальную Tm, необходимо учитывать все возможные динуклеотиды в конкретной последовательности.Для того чтобы подобрать оптимальную Tm на примере праймера GMI_DS_LB_459 к гену Pc38, нами был использован температурный градиент 55,0–70,0 °С, режим амплификации 2 и реакционная смесь 3. В результате получено множество неспецифичных фрагментов. Однако электрофореграммы продуктов амплификации образцов В1 и В3, в генотипе которых присутствует ген Pc38, не отличались от электрофореграмм других образцов, в том числе и от отрицательного контроля (В12 и В13) (рис. 3).   Рис. 3. Продукты амплификации с праймером GMI_DS_LB_459, полученные при использовании ДНК в 10-кратном разведении образцов В1–В13, смесь 3, градиент температур. 57,9–70,0 °С – Tm праймера Как видно из рисунка 3, с повышением температуры происходит уменьшение эффективности ПЦР-реакции, о чем свидетельствует снижение окраски бэндов. Схожую картину отмечала Г.Д. Абишева с соавт. при разработке протокола амплификации для выявления бруцелл [10].Установлено, что использование концентрированной ДНК давало более четкие продукты амплификации, поэтому в дальнейших исследованиях разведенную ДНК не применяли. Для анализа ДНК образцов использовали смеси 2, 3 и 4, режимы амплификации 2 и 3. Температуру отжига подбирали для каждого праймера индивидуально.   Рис. 4. Продукты амплификации, полученные при использовании ДНК образцов В1–В13 (1–13) и С1–С20 (14–33), смеси 3, режим амплификации 2, Тm = 56,0 °С. 1–13 – порядковые номера образцов В1–В13, 14–33 – образцов С1–С20. Подписи на рисунке обозначают ген устойчивости и используемый праймер  В результате были получены продукты амплификации, визуализирующиеся на геле в виде четких бэндов. Однако, несмотря на применение различных смесей и режимов амплификации, нами не был выявлен полиморфизм при использовании анализируемых праймеров. Ни для одного из сортов – источников генов Pc не было получено продуктов амплификации, отличающих их от образцов без данных генов.Известно, что молекулярные маркеры, разработанные на одной картирующей популяции, могут оказаться неэффективными при использовании их на другой. В связи с этим любые молекулярные маркеры должны быть верифицированы на большом объеме генетически разнообразного материала [8, 15,16]. Праймеры, анализируемые нами в данной статье, были получены на определенных картирующих популяциях овса и показали высокую эффективность при использовании на этих коллекциях. Однако, как показывают полученные нами результаты, эти ДНК-маркеры не подходят для выявления генов устойчивости к корончатой ржавчине в других популяциях и генетических коллекциях. Помимо оценки эффективности других известных праймеров к генам устойчивости к корончатой ржавчине овса, выходом в данной ситуации может стать создание собственной маркерной системы, включающей в себя анализ информации о нуклеотидных последовательностях участка генома, например с использованием молекулярных маркеров, описанных C.P. Wight et al. (2015) [17]; конструирование праймеров; подбор условий амплификации и экспериментальную проверку работоспособности полученных праймеров.Заключение 1. С использованием генетических коллекций образцов овса сибирской селекции проведена оценка ДНК-маркеров к высокоэффективным генам устойчивости к корончатой ржавчине. Для каждого из праймеров подобраны оптимальные состав реакционной смеси и режим амплификации, позволяющие получать продукты амплификации, визуализирующиеся при разделении в виде четких бэндов.2. Ни с одним из исследованных праймеров не было получено продуктов амплификации, позволяющих сделать вывод о наличии или отсутствии в анализируемых генотипах определенных генов устойчивости к корончатой ржавчине, что свидетельствует об их неэффективности для оценки генетической коллекции образцов сибирской селекции.3. Для успешного проведения маркер-ассоциированной селекции овса на устойчивость к корончатой ржавчине в Западной Сибири необходима оценка эффективности других известных праймеров к высокоэффективным генам Pc, а также создание собственных маркерных систем.