Введение. Растения отличаются широким спектром синтезируемых химических структур и являются крупнейшим источником первичных и вторичных метаболитов, используемых в пищевых, фармацевтических и косметических продуктах. В настоящее время именно из природных источников, таких как травы или лекарственные растения, предпочитают извлекать биологически активные вещества (БАВ). Культуры растительных клеток с продуцированием ценных вторичных метаболитов исследуются биотехнологическими методами и являются потенциальным альтернативным источником для производства биологических веществ промышленного значения. Интерес к лекарственным растениям возрос за последние два десятилетия вследствие их безопасного влияния на здоровье и более низкой стоимости по сравнению с синтетическими лекарствами [1–3].Метаболиты растений могут быть выделены из естественно выращенных растений, но их коммерческое производство сдерживается в связи с экологическими и региональными ограничениями. Применение таких растений в качестве источника БАВ требует много времени, так как растению необходимо несколько лет, чтобы вырасти и продуцировать метаболиты. Альтернативным методом получения метаболитов считается использование культуры тканей растений для эффективного производства БАВ за короткий промежуток времени. Данный способ позволяет применять массовое размножение растений в контролируемых условиях окружающей среды без каких-либо сезонных ограничений. При этом важно эффективно, без потери и разрушения метаболитов, проводить экстракцию из суспензионных культур клеток растений. Данному аспекту посвящена настоящая работа. Существует острая необходимость в разработке эффективных и селективных методов извлечения биологически активных природных соединений [4–6].Экстракция – это первый шаг для разделения БАВ от сырья. Методы экстракции включают экстракцию растворителем, метод дистилляции, прессование и сублимацию по принципу экстракции. Экстракция растворителем – наиболее широко используемый метод. Выбор растворителя имеет решающее значение для экстракции растворителем. При выборе растворителей следует учитывать селективность, растворимость, стоимость и безопасность. В традиционных методах экстракции, включая мацерацию, перколяцию и экстракцию с обратным холодильником, обычно используют органические растворители и требуют большого объема растворителей и длительного времени экстракции. Некоторые современные и более экологичные методы экстракции, такие как сверхкритическая жидкостная экстракция (SFC), жидкостная экстракция под давлением (PLE) и микроволновая экстракция (MAE), также применяются при экстракции БАВ и имеют некоторые преимущества по сравнению с традиционными методами – это меньший расход органических растворителей, более короткая продолжительность экстракции и более высокая селективность [7–10].Цель исследования. Подбор наилучших параметров получения тотальных экстрактов из суспензионных культур лекарственных растений шлемника обыкновенного, шлемника байкальского, лапчатки белой, лимонника (лимонника китайского), любки двулистной, кодонопсиса мелковолосистого.Ранее проводимые исследования были направлены на подбор наиболее эффективных экстрагирующих систем для получения комплекса БАВ из высушенной биомассы суспензионных культур клеток лекарственных растений методом экстракции по Сокслету. Так, в результате опытов было определено, что наиболее эффективным растворителем в отношении суспензионных культур шлемника байкальского и шлемника обыкновенного будет являться водный раствор этилового спирта с массовой долей 70 %, лимонника китайского и любки двулистной – ацетон, лапчатки белой – диэтиловый эфир, кодонопсиса мелковолосистого – этилацетат [11, 12].Методы и объекты исследования. В настоящей работе объектами исследования выступали суспензионные культуры клеток растений, произрастающих в Сибирском федеральном округе (СФО): шлемник обыкновенный, шлемник байкальский, лапчатка белая, лимонник (лимонник китайский), любка двулистная, кодонопсис мелковолосистый.Эксперимент запускали, когда предварительно были получены высушенные до постоянной массы влажностью не более 10 % суспензионные культуры лекарственных растений. Высушивание биомассы суспензированных культур клеток лекарственных растений осуществлялось при температурном воздействии в пределах 50–60 °С.Навески массой 2,0 г высушенных образцов лекарственных растений помещали в пробирки на 50 мл и экстрагировали различными органическими растворителями, добавив в каждую пробу по 35 мл. Пробирки оставляли в шейкере на 1 час с целью перемешивания. Образовавшийся в результате перемешивания раствор фильтровали, а также дополнительно центрифугировали для исключения взвешенных частиц при 4000 об/мин. Затем определяли вес колбы на 100 мл, переливали в нее фугат и упаривали при пониженном давлении. Завершив процесс упаривания, определяли вес колб с образцами, а затем вычитали массу пустых колб и таким образом вычисляли выход экстракта [13–16].После определения наиболее эффективного органического растворителя для каждого образца суспензионных культур лекарственных растений СФО подбирали наилучшие параметры экстрагирования комплекса БАВ. В качестве изменяемых параметров в процессе экстрагирования были выбраны продолжительность экстракции, температурный режим и отношение объема растворителя к высушенной массе суспензионных культур лекарственных растений.Результаты исследования и их обсуждение. Результаты определения выхода тотального экстракта высушенных суспензионных культур лекарственных растений в зависимости от вида органического растворителя отражены в таблице 1. Таблица 1Подбор органического растворителя для экстракции БАВ из высушенной биомассысуспензионных культур клеток лекарственных растений СФО РастениеВыход тотального экстракта, %МетанолЭтилацетатАцетонИзопропанолДиэтиловый эфир70% этанолШлемник байкальский3,12±0,311,53±0,154,62±0,462,74±0,270,87±0,099,32±0,93 Лапчатка белая3,61±0,361,27±0,130,31±0,931,70±0,177,37±0,745,11±0,51Шлемник обыкновенный1,78±0,180,89±0,090,46±0,052,05±0,210,43±0,048,72±0,87Кодонопсис мелковолосистый2,14±0,218,10±0,810,36±0,041,56±0,160,59±0,064,47±0,45Любка двулистная2,58±0,260,57±0,067,73±0,770,68±0,070,74±0,074,21±0,42Лимонник китайский2,53±0,251,32±0,139,16±0,921,58±0,160,27±0,034,35±0,44  Согласно результатам эксперимента, подобраны наиболее эффективные экстрагирующие системы в отношении суспензионных культур лекарственных растений СФО для получения комплекса биологических веществ. Наиболее эффективным органическим растворителем в отношении суспензионных культур шлемника байкальского и шлемника обыкновенного является 70 %-й этиловый спирт, лимонника китайского и любки двулистной – ацетон, лапчатки белой – диэтиловый эфир, кодонопсиса мелковолосистого – этилацетат.Основное направление работы заключалось в подборе наилучших параметров экстрагирования биологически активных веществ из суспензионных культур лекарственных растений шлемника обыкновенного, шлемника байкальского, лапчатки белой, лимонника, любки двулистной, кодонопсиса мелковолосистого. Результаты исследования приведены в таблицах и на графиках. Главным параметром, по которому происходила оценка эксперимента, являлся максимальный выход сухого экстракта лекарственных растений.На рисунках 1 и 2 представлены результаты подбора параметров экстрагирования комплекса БАВ из высушенной биомассы суспензионной культуры лекарственного растения шлемника байкальского.    Рис. 1. Выход сухого экстракта комплекса БАВ из высушенной биомассысуспензионной культуры шлемника байкальского в зависимости от продолжительностиэкстрагирования и гидромодуля  Рис. 2. Подбор температурного режима процесса экстрагирования комплекса БАВиз суспензионной культуры шлемника байкальского  В результате проведения серии экспериментов по подбору параметров для процесса экстрагирования комплекса БАВ из биомассы суспензионной культуры лекарственного растения шлемника байкальского максимальный выход биологических веществ был достигнут при температуре процесса 50 °С, продолжительности – 60 мин и соотношении объема экстрагента к массе высушенного образца 1 : 10. В качестве наиболее эффективного экстрагента в отношении шлемника байкальского был использован 70 %-й этиловый спирт. Максимальный выход комплекса БАВ при данных параметрах процесса достигает 7,96 %. На серии графиков можно заметить, что температурный показатель постепенно либо резко возрастает с течением времени и в определенном значении достигает своего максимума, однако затем идет постепенное снижение или стабилизация выхода экстракта, что может быть связано с разрушением метаболитов при увеличении продолжительности процесса.Результаты подбора параметров экстрагирования биологических веществ из суспензионной культуры лекарственного растения лапчатки белой приведены в таблицах 2, 3.  Таблица 2Выход сухого экстракта комплекса БАВ из суспензионной культуры лапчатки белойв зависимости от продолжительности экстрагирования и гидромодуля Vр-ля/mкультурыВыход экстракта, %, при разной продолжительности процесса, мин1030601201803601:10,50±0,050,81±0,081,22±0,121,29±0,131,38±0,141,38±0,141:20,80±0,080,94±0,091,35±0,141,58±0,161,67±0,171,71±0,171:51,20±0,121,80±0,182,78±0,284,12±0,414,45±0,454,81±0,481:101,40±0,143,98±0,406,46±0,657,45±0,757,12±0,717,37±0,741:201,40±0,142,01±0,207,57±0,766,35±0,646,41±0,646,53±0,65Таблица 3Подбор температурного режима процесса экстрагирования комплекса БАВиз суспензионной культуры лапчатки белой Температура, °СВыход экстракта, %, при разной продолжительности процесса, мин103060120180360251,20±0,121,80±0,182,78±0,285,88±0,595,95±0,605,81±0,58401,55±0,169,98±1,008,92±0,898,21±0,828,18±0,828,24±0,82601,79±0,188,35±0,848,68±0,878,74±0,879,01±0,909,12±0,911001,62±0,168,14±0,819,04±0,909,12±0,919,14±0,919,17±0,92  Согласно таблицам 2 и 3, наилучшими параметрами процесса экстракции с максимальным выходом биологически активных веществ из высушенных образцов суспензионной культуры лапчатки белой являются температура 40 °С, гидромодуль 1:20 и продолжительность процесса экстракции 60 мин. Диэтиловый эфир используется как самый эффективный органический растворитель растительного образца лапчатки белой с максимальным выходом комплекса БАВ 9,98 %.В таблицах 4, 5 отражены результаты параметров – температурного режима, гидромодуля и продолжительности процесса экстрагирования комплекса БАВ из высушенной биомассы суспензионной культуры лекарственного растения шлемника обыкновенного.  Таблица 4Выход сухого экстракта комплекса БАВ из суспензионной культурышлемника обыкновенного в зависимости от продолжительности экстрагированияи гидромодуля Vр-ля/mкультурыВыход экстракта, %, при разной продолжительности процесса, мин1030601201803601:13,50±0,357,81±0,787,22±0,727,29±0,737,38±0,747,38±0,741:23,80±0,387,94±0,797,35±0,747,58±0,767,67±0,777,71±0,771:54,20±0,429,84±0,989,78±0,989,12±0,919,45±0,959,81±0,981:105,40±0,549,98±1,008,46±0,858,45±0,858,12±0,818,37±0,841:206,40±0,649,01±0,907,97±0,808,35±0,848,21±0,828,31±0,83    Таблица 5Подбор температурного режима процесса экстрагирования комплекса БАВ из суспензионной культуры шлемника обыкновенного Температура, °СВыход экстракта, %, при разной продолжительности процесса, мин103060120180360251,20±0,121,80±0,182,78±0,285,88±0,595,95±0,605,81±0,58401,55±0,161,98±0,203,92±0,396,21±0,626,18±0,626,24±0,62601,79±0,189,35±0,948,68±0,878,74±0,878,81±0,888,62±0,86701,62±0,169,14±0,918,04±0,808,12±0,818,14±0,818,17±0,821001,62±0,168,14±0,818,04±0,808,12±0,818,14±0,818,17±0,82  Максимальный выход экстракта комплекса БАВ из суспензионной культуры шлемника обыкновенного наблюдается при следующих параметрах: гидромодуль 1:10, продолжительность процесса экстракции 30 мин и температура 60 °С. В качестве органического растворителя применяется 70 %-й этанол, использование которого обеспечивает максимальный выход комплекса БАВ 9,98 %.Далее подбирали параметры экстракции биологических веществ из суспензионной культуры кодонопсиса мелковолосистого в зависимости от продолжительности экстракции, гидромодуля и температуры процесса, представленные на рисунках 3 и 4.    Рис. 3. Выход сухого экстракта комплекса БАВ из суспензионной культурыкодонопсиса мелковолосистого в зависимости от продолжительности экстрагированияи гидромодуля  Рис. 4. Подбор температурного режима процесса экстрагирования комплекса БАВиз суспензионной культуры кодонопсиса мелковолосистого  Результатом подбора параметров экстрагирования комплекса БАВ является максимальный выход биологических веществ из лекарственного растения кодонопсиса мелковолосистого, который составляет 9,46 %. Такими параметрами являются: температура процесса экстракции – 40 °С, продолжительность – 60 мин, гидромодуль – 1 : 10. Органическим растворителем выступает этилацетат. Из графиков следует, что наиболее высокий выход достигается при использовании средних температур и относительно невысоких показателей продолжительности процесса. В остальных случаях происходит снижение доли выхода экстракта.На рисунках 5, 6 представлены результаты подбора параметров экстракции биологических веществ из высушенной биомассы суспензионной культуры лекарственного растения любки двулистной.    Рис. 5. Выход сухого экстракта комплекса БАВ из суспензионной культуры любки двулистной в зависимости от продолжительности экстрагирования и гидромодуля  Рис. 6. Подбор температурного режима процесса экстрагирования комплекса БАВиз суспензионной культуры любки двулистной  Данные, представленные на графиках 5, 6, показывают, что параметрами, при которых был достигнут максимальный выход экстракта комплекса биологических веществ, составляющий 8,47 %, являются температура процесса при 40 оС, продолжительность экстракции 30 мин и соотношение ацетона и суспензионной культуры 1 : 5.Результаты процесса экстрагирования комплекса БАВ из биомассы суспензионной культуры лекарственного растения лимонника китайского отражены в таблицах 6, 7.  Таблица 6Выход сухого экстракта БАВ из суспензионной культуры лимонникав зависимости от продолжительности экстрагирования и гидромодуля Vр-ля/mкультурыВыход экстракта, %, при разной продолжительности процесса, мин1030601201803601:10,50±0,050,81±0,081,22±0,121,29±0,131,38±0,141,38±0,141:20,80±0,080,94±0,091,35±0,141,58±0,161,67±0,171,71±0,171:51,20±0,127,80±0,787,78±0,787,12±0,717,45±0,756,81±0,681:101,40±0,147,98±0,807,46±0,757,45±0,757,12±0,717,37±0,741:201,40±0,147,01±0,707,57±0,767,35±0,747,41±0,747,53±0,75  Таблица 7Подбор температурного режима процесса экстрагирования комплекса БАВиз суспензионной культуры лимонника Температура, °СВыход экстракта, %, при разной продолжительности процесса, мин103060120180360251,20±0,121,80±0,182,78±0,285,88±0,595,95±0,605,81±0,58401,55±0,1610,98±1,109,92±0,999,21±0,929,18±0,929,24±0,92601,79±0,1810,35±1,049,68±0,979,74±0,979,71±0,979,12±0,911001,62±0,169,14±0,919,04±0,909,12±0,919,14±0,919,17±0,92  Согласно полученным данным, параметры, при которых можно проводить процесс экстракции суспензионной культуры лимонника китайского ацетоном с максимальным выходом экстракта комплекса БАВ 10,98 %, будут составлять 40 °С, в соотношении ацетона к массе высушенного лимонника 1 : 5 и продолжительностью экстракции 30 мин.Таким образом, были проведены исследования по подбору параметров процесса экстрагирования комплекса БАВ из высушенных суспензионных культур лекарственных растений Сибирского федерального округа шлемника обыкновенного, шлемника байкальского, лапчатки белой, лимонника китайского, любки двулистной, кодонопсиса мелковолосистого. Основными параметрами экстракции, по которым происходит изменение и контроль процесса, являются продолжительность экстрагирования, температурный режим и соотношение объема экстрагента к количеству высушенной биомассы суспензионных культур клеток растений. Также к каждому образцу лекарственного растения был подобран органический растворитель, который обеспечивает максимальный выход биологических веществ из исходного сырья.Выводы. Итоговые результаты по подбору параметров процесса экстрагирования комплекса БАВ из высушенных суспензионных культур лекарственных растений СФО объединены в таблицу 8.  Таблица 8Наилучшие параметры экстрагирования комплекса БАВ из высушенной биомассысуспензионных культур клеток лекарственных растений РастениеОрганический растворительГидромодульПродолжительность, минТемпература, °СШлемник байкальский70 % этанол1 : 106050Лапчатка белаяДиэтиловый эфир1 : 203040Шлемник обыкновенный70 % этанол1 : 103060Любка двулистнаяАцетон1 : 53040ЛимонникАцетон1 : 53040КодонопсисмелковолосистыйЭтилацетат1 : 103040  Таким образом, для получения экстрактов комплекса БАВ были использованы суспензионные культуры лекарственных растений СФО, выращенных in vitro: шлемника обыкновенного, шлемника байкальского, лапчатки белой, лимонника китайского, любки двулистной, кодонопсиса мелковолосистого. Были подобраны наилучшие параметры экстрагирования биологических соединений и эффективные органические растворители в отношении каждого представленного растения.В заключение следует отметить очевидный и растущий интерес к выделению биологически активных соединений из растений, выращенных in vitro, и их выгодному применению. Ожидается, что тенденция роста в ближайшем будущем сохранится, поскольку спрос на БАВ, которые получают из экологического сырья, постоянно растет со стороны потребителей, а также использование такого сырья решает насущные проблемы загрязнения окружающей среды.