Введение. Эффективное управление реализацией генофонда высокопродуктивных сельскохозяйственных животных возможно лишь на основании научно обоснованных данных, полученных с помощью разноуровневых индикаторов. Проявление высокой продуктивности сельскохозяйственных животных обеспечивается интенсивным функционированием всех органов и систем организма, стабильность и устойчивость работы которых зависит от множества факторов эндогенной и экзогенной природы. Отклонение последних от оптимальных пределов приводит к сбою гомеостатического режима работы данного организма с потерей не только продуктивности и здоровья, но и даже его жизнеспособности [1, 2]. В связи с этим выявление первичных критических моментов изменения состояния организма является актуальной задачей, решение которой позволяет на ранних стадиях классифицировать неблагоприятное влияние и принять меры к устранению воздействия. Одной из главнейших связующих систем целостного организма является периферическая кровь. Она не только обеспечивает нормальное функционирование организма, но и является активно действующей составной частью системы неспецифической резистентности и специфического иммунитета. Исследование цитоморфологического состава и биохимических характеристик периферической крови имеет большое диагностическое значение [1, 2]. Особую роль в обеспечении неспецифической резистентности, как первичной защитной реакции на экзогенные и эндогенные раздражители, играют клетки крови, способные к фагоцитозу [3]. Проявление функциональной активности фагоцитов на всех этапах фагоцитарного процесса сопровождается продукцией активных форм кислорода (АФК), слабо выраженной в состоянии нормы и протекающей в виде респираторного взрыва в состоянии антигенной активации [3]. В зависимости от объема генерируемые АФК способны повреждать не только чужеродные агенты, но и собственные молекулярные структуры. В норме регуляция продукции АФК и свободных радикалов в тканях и органах осуществляется многоуровневой физиологической антиоксидантной системой, которая включает в себя соединения различной химической природы: витамины, пигменты, гормоны, ферменты [4]. Важной составляющей, описывающей состояние гомеостаза, является оптимальный баланс окислительно-восстановительных реакций: равновесие между процессами образования АФК и реакциями антиоксидантной системы. Разные комбинации экзо- и эндогенных факторов могут привести к сдвигу равновесия оксиданты – антиоксиданты, что неблагоприятно воздействует на организм.В связи с этим, осуществляя мониторинг функциональной активности иммунокомпетентных клеток крови (ИКК), выполняемый на молекулярном уровне по кинетике генерации АФК клетками периферической крови с помощью хемилюминесцентного (ХЛ) метода, можно выявить тонкие изменения в механизмах функционирования системы иммуногенеза, не всегда проявляющиеся на субклеточном и клеточном уровнях, но вместе с тем играющие ключевую роль в формировании патогенетических механизмов. Интенсивность хемилюминесценции коррелирует с потреблением клетками кислорода и степенью завершенности фагоцитоза, поэтому имеет смысл оценить интегральную составляющую, отражающую резервные возможности антиоксидантного потенциала. ХЛ-кривая кинетики генерации АФК ИКК является одним из интегральных показателей состояния системы иммуногенеза, и ее регистрация может служить одним из экспресс-методов ранней диагностики иммунодефицитных состояний [5–8].Цель исследований. Изучить зависимость функциональной активности антигенактивированных in vitro клеток крови быков от эндогенных и экзогенных факторов. Задачи: выявление значимых факторов, влияющих на генерацию АФК клетками крови; установление параметров влияния этих факторов.Материалы и методы исследований. В качестве объекта использована периферическая кровь клинически здоровых быков–спермодоно­ров ОАО «Красноярскгосплем», отбираемая в период ежегодных плановых весенне-осенних и внеплановых зимних [И.Ю.1] ветеринарных обследований 1999–2014 гг. Функциональную активность клеток крови при антигенной стимуляции in vitro оценивали по кинетике генерации АФК, регистрируемой микрометодом люминолусиленной хемилюминесценции с использованием аппаратурно-программного комплекса «Хемилюминометр CL-3604» – ПЭВМ (СКТБ «Наука» СО РАН) [9, 10]. Время записи хемилюминесцентной кривой составляло 180 минут при температуре в регистрационной камере 37 ºС. Реакционная смесь регистрационной кюветы состояла из 200 мкл 2,2·10-4 М люминола (Sigma) в растворе Хенкса (рН – 7,2), 100 мкл гепаринизированной крови животных в разведении 1:1 в растворе Хенкса, 50 мкл суспензии монодисперсных частиц латекса (ВНИИСК, С-Петербург) в растворе Хенкса концентрацией 5·108 част/мл, опсонизированных белками пуловой сыворотки крови крупного рогатого скота. О кинетике генерации АФК в системе клеток цельной крови быков судили по параметрам хемилюминесцентной кривой, принимая во внимание наиболее информативные: амплитуду максимальной активности хемилюминесцентной реакции (Imax – имп/с), время достижения максимума (Tmax – мин) и площадь под кривой хемилюминесценции (S – имп. за 180 мин), определяющей общее количество АФК, генерируемых клетками за время записи хемилюминесцентной кривой. Анализ хемилюминесцентной кинетики генерации АФК и оценку функционального состояния клеток крови[И.Ю.2]  выполняли по методу M.Y. Magrisso et al. [9]. Статистическую обработку данных и дисперсионный двухфакторный анализ осуществляли по алгоритмам пакета «анализ данных» программы Microsoft Excel. Результаты и их обсуждение. При используемом разведении образцов крови регистрируемая хемилюминесцентная кинетика генерации АФК клетками при антигенной активации in vitro характеризовалась двумя максимумами (рис.1) [10]. Формирование первого из них отражает активацию фагоцитарного процесса (адгезия, поглощение частиц латекса). Второй пик генерации АФК обусловлен эндогенной активацией «резервных» нейтрофилов [11], а также образованием липидных и белковых пероксидов [5, 6].Многолетние исследования функциональной активности клеток крови здоровых быков-спермодоноров ОАО «Красноярскгосплем» выявили возрастную и сезонную динамику способности клеток крови генерировать АФК в ответ на антигенную стимуляцию in vitro [11, 12], которая проявляется прежде всего в изменении соотношения амплитуды первого и второго максимума интенсивности хемилюминесценции (рис. 1). Амплитуда первого максимума (Imax1) с возрастом изменяется незначительно, но проявляется тенденция снижения, начиная с двухлетнего возраста, наиболее заметно проявляющаяся в весенний период (рис. 2). Наименьшие значения (726±73 имп/с) выявлены у быков в возрасте старше 4–5 лет в весенний период, в то время как размах величин второго максимума (Imax2) составлял от 1447± 87 имп/с в группе 37–48 мес. до 3887±525 имп/с в группе старше 61–72 мес. в весенний период и от 1133±115 (возраст 19–24 мес.) до 3227±931 (возраст 61–72 мес.) при общей тенденции снижения величины первого и повышения второго максимума в возрасте старше 36 мес. Время достижения первого и второго максимума также является важной характеристикой продукции АФК (табл. 1).   Таблица 1Значение параметров времени достижения первого (TmaxI)и второго (TmaxII) максимумов ХЛ кинетики генерации клетками крови быковразновозрастных групп в разные сезонные периоды Возраст,месяцTmax(I), минTmax(II), минОсеньnЗимаnВеснаnОсеньnЗимаnВеснаnДо 1818±26415±12019±435133±264130±320123±6*3519–2418±176––19±236123±376––122±33625–3617±112614±1921±293121±2126118±69122±39337–4818±24918±1822±268124±349120±68133±3*6849–6019±26413±81220±343123±364116±712131±6*4361–7217±8178±35213±530124±717169±232125±930Старше 73 16±61211±2219±513131±812165±32132±813* Достоверные отличия от значений осенью (P < 0,05).  Следует отметить, что оно имеет четкие периоды проявления, связанные, вероятнее всего, с видовой особенностью. Первый максимум достигается на 18±1 минуте осенью, 17±1 минуте зимой[И.Ю.3] [EA4] , на 19±1 – весной. Второй максимум на 127±2 мин весной, 127±3 – зимой и 126±2 – осенью. Однако есть достоверные отличия этих параметров для одновозрастных групп в различные сезонные периоды (см. табл. 1).Регистрируемая хемилюминесцентная кинетика генерации АФК клетками крови при антигенной активации in vitro представляет собой интегральную характеристику продукции АФК во вне- и внутриклеточную среду при участии клеточных про- и антиоксидантных ферментативных структур, активирующихся в процессе фагоцитоза, и про- и антиоксидантных факторов, функционирование которых напрямую не связано с фагоцитозом (супероксиддисмутаза[EA5] [И.Ю.6]  (СОД) эритроцитов, металлы с переменной валентностью, витамины и др.). Согласно методу анализа ХЛ кинетики по M.Y. Magrisso et al. [9], каждая хемилюминесцентная кинетическая кривая может быть представлена как сумма трех статистических распределений-компонент (рис. 2). Первая компонента представляет процессы, связанные с фагоцитозом и происходящие около плазматической мембраны, отражает кинетику внеклеточной генерации АФК при распознавании и адгезии. Вторая компонента характеризует процессы внутри клетки, связанные с фагоцитозом, и представляет внутриклеточную генерацию АФК. Третья компонента описывает кинетику генерации внутриклеточных АФК, напрямую не связанной с фагоцитозом [9].    Рис. 1. Возрастная динамика амплитуды максимумов (Imax1 и Imax2), кинетики продукции АФКантигенактивированными in vitro клетками быков-производителейв весенний и осенний периоды (1999–2014 гг.).   Рис. 2. Компонентная структура люминолусиленной хемилюминесцентной кинетики генерации АФК клетками крови быков-спермодоноровразного возраста [И.Ю.7] в зимний[EA8] [И.Ю.9]  период  Компонентный анализ кинетики генерации АФК клетками крови разновозрастных групп быков, по M.Y. Magrisso et al. [9], показал, что изменение с возрастом интегрального объема S генерации люминолзависимых АФК с общей тенденцией увеличения к 6–7 годам определяется изменением третьей компоненты, характеризующей фагоцитознезависимую генерацию АФК (см. рис. 2). В старшем возрасте (73 мес. и старше) отмечено снижение показателя на 21,8 % от максимального значения в предыдущий период. При этом изменение ХЛ показателей соотносится с изменением гомеостаза и продуктивности спермодоноров. Так, Е.В. Четвертакова (2016) указывает, что «…быки в возрасте до двух лет характеризуются нестабильными половыми функциями, в результате чего от них было получено минимальное количество семени» [13]. По результатам компонентного анализа этот период (до 18 месяцев) характеризуется самой высокой величиной S первой и второй компоненты (табл. 2) при сравнительно низких показателях S третьей компоненты, что определяется высокой активностью про- (НАДФН-оксидазы, миелопероксидазы) и антиоксидантных ферментов (СОД, каталазы), участвующих в формировании респираторного взрыва при фагоцитозе [3, 5]. И в то же время достаточно высока активность антиоксидантных ферментов глутатионового ряда (глутатионпероксидазы, глутатионтрансферазы, глутатионредуктазы), роль которых весьма значима в окончательной дисмутации образующихся свободных кислородных, липидных и белковых радикалов [6].То есть период до 1,5 лет, наряду с пониженными биотехнологическими показателями спермопродукции, характеризуется сравнительно высокой активностью внутриклеточных и про- и антиоксидантных систем[EA10] [И.Ю.11] .Исследованиями возрастного изменения баланса активности про- и антиоксиданых ферментов в нейтрофилах [14] выявлена наиболее высокая активность про- и антиоксидантных ферментов в молодом возрасте организма с закономерным снижением активности всех типов антиоксидантных ферментов, причем более интенсивным для каталазы, и увеличением перикисного окисления липидов и белковых молекул. Очевидно, следствие этого процесса регистрируется в наших исследованиях возрастного изменения хемилюминесцентной кинетики генерации АФК: снижение активности нарастания респираторного взрыва при активации фагоцитоза и его медленное гашение.Значение максимальной интенсивности фагоцитозсвязанной продукции АФК у особей не старше 4 лет в осенний период несколько выше, чем величина второго максимума, в весенний же период средние величины первого максимума достоверно (P < 0,05) меньше средних величин второго максимума, к тому же в периферической крови крупного рогатого скота[И.Ю.12]  количественно доминирует фракция лимфоцитарных клеток (60–70 % лейкоцитов), не участвующих в фагоцитозе. Рассматривая покомпонентно характеристику времени достижения максимума, выявили устойчивые периоды достижения максимума вне зависимости от сезона по 1-й и 2-й компоненте, 8-я и 23–25-я минута соответственно. Третья компонента достигает своего максимума быстрее зимой (117±2 мин), а осенью и весной позднее соответственно на 126±1 и 130±2 мин.Используя значения показателей модельных составляющих, выполнили оценку функционального состояния фагоцитирующих клеток крови КРС разного возраста. У быков разного возраста функциональное состояние клеток крови, генерирующих АФК при инициации фагоцитоза, по методу Magrisso et. al. [10] характеризуется в основном как «альтернативно активированное» в осенний и зимний период[И.Ю.13] ы и «отдыха» в весенний (см. табл. 2).Таким образом, объем АФК, связанных с фагоцитозом, у клинически здоровых быков-спер­модоноров зависит от сезона. При этом доля общей продукции АФК, связанной с фагоцитозом, составляет не более 41 % в зимний период. Минимальная доля фагоцитозсвязанной продукции АФК регистрировалась в весенний период – 12 %, что достоверно (P < 0,05) меньше, чем в осенний и зимний период.   Таблица 2 Сезонно-возрастные особенности функционального состояния лейкоцитарных клеток кровибыков-спермодоноров при активации фагоцитоза in vitro Возраст, месяцВеснаОсеньЗимаТипактивности клеток кровиДоля (%)фагоцитоз-связаннойпродукцииАФКТипактивности клеток кровиДоля (%)фагоцитоз-связаннойпродукцииАФКТипактивности клеток кровиДоля (%)фагоцитоз-связанной продукцииАФКВсе116,9229,8232,4До 18121,2136,0241,119–24122,8233,6--25–36118,8231,6128,537–48120,7231,6220,549–60112,7226,3231,061–72112,3212,8119,6Старше 73112,3216,0121,0Примечание: 1 – состояние «отдыха» при слабой презентации антигена, нет готовности к активному бактерицидному действию; 2 – состояние «альтернативной активации», клетки активно генерируют АФК при фагоцитозе, но большее количество АФК генерируется вне фагоцитоза.  Для анализа значимости влияния из группы факторов, воздействующих на процессы образования АФК клетками крови, выбраны два независимых – «возраст животного» и «сезон» (табл. 3).  Таблица 3Дисперсионный анализ влияния факторов «сезон» и «возраст животного»на интегральный объем генерации АФК клетками крови быков-спермодоноров(S, имп. за 180 мин) ИсточниквариацииSSdfMSFP-значениеFкритич.Сезон1,416·101534,722·10142,7770,044802,689Возраст5,885·101522,943·101517,3050,000000033,080Взаимодействие[EA14]  факторов4,134·101566,890·10144,0520,001062,184Внутри[EA15] 1,836·10161081,700·1014–––Итого[EA16] [И.Ю.17] 2,980·1016119––––Примечание. Источники вариации: «внутри» – случайная; «итого» – общая.  Взаимодействие факторов в данном случае означает, что интегральный объем генерации АФК в различные сезоны зависит от возраста животного.[И.Ю.18] Поскольку по фактору «сезон» критерий Фишера F = 2,77 > Fкритич = 2,689, а р-значение равно 0,0448 и меньше уровня значимости, гипотеза Н0 отклоняется. Следовательно, можно утверждать, что между интегральным объемом генерации АФК в разные сезоны существует разница. По фактору «возраст» F = 17,305 > F критич. = 3,080, а р-значение равно 0,3·10-7 и меньше уровня значимости, гипотеза Н0 отклоняется. Следовательно, значение площади свечения S, характеризующего объем генерации АФК за время регистрации, статистически значимо (p < 0,001) зависит от возраста животного.Выводы. Функциональная активность клеток крови быков-производителей, оцениваемая по способности генерировать АФК при антигенной активации in vitro, имеет двухфазную кинетику и характеризуется закономерной возрастной динамикой и сезонной зависимостью. Кинетика генерации АФК характеризуется стабильными параметрами времени достижения максимумов и изменяющимися в зависимости от возраста и сезона максимальной интенсивностью первого (Imax1) и второго (Imax2) максимумов и общего объема (S) генерируемых АФК.Увеличение интегрального объема продукции всех видов АФК[EA19] [И.Ю.20]  люминолзависимых АФК определяется ростом максимальной интенсивности и объема третьей компоненты генерации свободных радикалов кислорода – внутриклеточной и внеклеточной[ГВ21] [EA22] , несвязанных с процессом фагоцитоза. У быков разного возраста состояние образования АФК в крови в основном «альтернативное активизированное» и только в возрасте 47–50 месяцев – «отдых».Эффект влияния взаимодействия факторов «сезон» и «возраст животного» на объем генерируемых АФК клетками крови быков статистически значим[EA23] [И.Ю.24]  (p < 0,01) при показателе силы влияния для взаимодействия 13,87 %. При этом сила влияния фактора «возраст животного» составляет 19,75 %, а влияние фактора «сезон» на объем АФК – 4,75 %. [И.Ю.1] добавила [И.Ю.2]заменить [И.Ю.3] материалы и методы дополнила [EA4]Откуда появилась зима? В материалах и методах идет речь об осенне-весенних ветеринарных обработках и взятии крови в эти сезоны.  [EA5]Супероксиддисмутаза ранее в тексте не упоминалась. Хорошо бы расшифровать аббревиатуру  [И.Ю.6]вставила [И.Ю.7]уточнила [EA8]Не указан возраст животных и опять ссылка на зимний период [И.Ю.9]да зимой [EA10] Вы описываете результаты у животных 18-мес. И делаете прямо противоположные выводы в соседних предложениях [И.Ю.11]изменено  [И.Ю.12]изменила [И.Ю.13] уточнила [EA14]Взаимодействие между возрастом и сезоном? [EA15]Внутри чего? В тексте отсутствует расшифровка [EA16]Итого? Это что за показатель? Нет комментариев [И.Ю.17]поскольку использован алгоритм двухфакторного анализа, рутинно используемый в рамках пакета данных, не принято подробно расшифровывать каждый показатель. [И.Ю.18]добавлено пояснение [EA19]Вы исследовали только люминолзависимые, т.е. вторичные АФК [И.Ю.20]изменено [ГВ21]Можно удалить, хотя не исключается образование липидных радикалов в плазме, ведь кровь не фракционировали и разводили всего в 2 раза, а интегрально в 7 раз. [EA22]В тексте выше вы указывали, что третья компонента – это ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ продукция АФК, не связанная с фагоцитозом. Откуда появляется внеклеточная? [EA23]Влияние сезона на продукцию АФК составляет, по вашим данным, 4,75%. Откуда высокая статистическая значимость? [И.Ю.24] По данному фактору меньше значение p=0,04480 что соответствует третьему порогу. Значение « сила влияния»- расчетное( производное от дисперсииПоказатели силы влияния считаем по столбцу SS, деля соответствующие значения на "Итого" и умножая на 100%.