Введение. Актуальность проблемы лечения ран у домашних и сельскохозяйственных животных обусловлена их высокой распространенностью, частотой возникновения и полифакторностью заболевания [1–3]. Арсенал ранозаживляющих средств в ветеринарии весьма ограничен, а их эффективность зачастую оказывается недостаточной для обеспечения полноценного восстановления тканей и предотвращения осложнений [4]. Во многом это связано с многообразием типов ран, спецификой этиопатогенеза и факторов, влияющих на процесс заживления, включая инфекционные агенты, механические повреждения, трофические нарушения и иммунные реакции организма. В связи с этим возникает необходимость поиска и внедрения новых препаратов комбинированного состава, способных эффективно воздействовать на различные аспекты раневого процесса [1, 5, 6]. Ввиду того, что раны бывают различного типа и различной степени тяжести, препараты для их лечения могут использоваться на протяжении продолжительного периода, особенно в случае осложненных ран, хронических или повторяющихся травм. В этой связи одним из ключевых направлений в разработке новых ранозаживляющих средств является конструирование препаратов, обладающих не только высокой специфической активностью, но и безопасностью применения. Поэтому вновь разработанные потенциальные препараты проходят тщательную оценку на всех этапах доклинического исследования, включая оценку общетоксических свойств [7]. Особое внимание при этом уделяется оценке острой и хронической (субхронической) токсичности новых фармакологических средств. Оценка острой токсичности позволяет оценить потенциальные риски, определить возможные негативные эффекты, связанные с краткосрочным использованием препарата. Хроническая (субхроническая) токсичность, в свою очередь, оценивается при длительном (от нескольких дней до нескольких месяцев) применении препарата и помогает выявить потенциальные кумулятивные эффекты, которые могут проявляться в виде нарушений функций различных органов и систем [8, 9]. Эти исследования критически важны для определения безопасных временных рамок и дозировок применения нового препарата и могут быть использованы как ключевые этапы исследования безопасности его применения.В отделе фармакологии ФГБНУ КНЦЗВ был разработан новый ранозаживляющий препарат «Маклозол» комбинированного состава с полифункциональными свойствами для ветеринарного применения. «Маклозол» представляет собой полупрозрачный гидрофильный однородный гель светло-коричневого цвета без видимых механических включений [10, 11]. Входящие в его состав активные компоненты природного и синтетического происхождения обладают выраженными лечебными свойствами – антибактериальными, антиэкссудативными, репаративными и регенерирующими. В рамках доклинического исследования «Маклозола» представлялось необходимым провести оценку его острой и субхронической токсичности.Цель исследования – оценить острую и субхроническую токсичности ранозаживляющего геля «Маклозол» на лабораторных животных. Исследование нацелено на установление безопасных дозировок применения препарата, анализ клинических признаков токсичности и выявление потенциальных негативных эффектов, связанных с длительным использованием препарата «Маклозол».Объекты и методы. Исследования проводились с соблюдением российских стандартов, касающихся проведения научных экспериментов на лабораторных животных («Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» под общей редакцией Р.У. Хабриева (2005); «Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств» (часть первая) под редакцией А.Н. Миронова (2012); правила проведения доклинического исследования лекарственного средства для ветеринарного применения (Приказ Минсельхоза РФ от 6 марта 2018 г. № 101 «Об утверждении Правил проведения доклинического исследования лекарственного средства для ветеринарного применения, клинического исследования лекарственного препарата для ветеринарного применения, исследования биоэквивалентности лекарственного препарата для ветеринарного применения»); ГОСТ 12.1.007-76 «Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности»; «Научно-методические аспекты исследования токсических свойств фармакологических лекарственных средств для животных» А.М. Смирнова, В.И. Дорожкина (2008)).Для изучения острой токсичности ранозаживляющего геля «Маклозол» были отобраны лабораторные крысы (n = 20) массой тела от 220 до 235 г по 10 лабораторных животных в опытную и контрольную группы. Выбранная для эксперимента возможная токсическая доза геля «Маклозол» составила 6000 мг/кг массы тела, при этом количество геля для каждого животного рассчитывалась индивидуально. Опытной группе животных вводили исследуемый препарат – ранозаживляющий гель «Маклозол». Для этого из геля готовилась 20–30 % водная суспензия, которая однократно вводилась крысам с использованием одноразового трехкомпонентного шприца через атравматичный зонд в объеме 5 мл на каждую особь. Сравнение проводилось с данными, полученными в ходе наблюдения за лабораторными животными контрольной группы, которым вводилась гелевая основа (плацебо), растворенная в аналогичной пропорции в дистиллированной воде, в количестве 5 мл однократно. Мониторинг состояния животных по возможным клиническим признакам токсичности (активность, диарея или другие нарушений со стороны ЖКТ, состояние кожи и шерсти) отмечали в течение 14 дней (ежедневно), с контрольными точками в 1-, 7- и 14-й день. При проведении эксперимента параметры состояния животных изучали в день эксперимента через каждый час от момента введения препарата; в течение последующих 3 дней – три раза в сутки; в оставшиеся дни до 14-го дня – один раз в сутки.Эксперимент по оценке субхронической токсичности включал длительное воздействие ранозаживляющего геля «Маклозол» на лабораторных животных. Лабораторные нелинейные крысы (n = 40) со массой тела от 145 до 156 г были разделены на четыре группы: 1-я опытная группа получала 1/10 от LD50 или, при отсутствии падежа, от максимально-испытанной дозы в эксперименте по определению острой токсичности, 2-я опытная группа – 1/20, 3-я опытная группа – 1/50, а 4-я, контрольная, группа получала плацебо в эквиобъемной дозе. Количество лабораторных животных – по 10 лабораторных крыс в каждой группе. Ежедневно, в течение 30 дней животные опытных групп (1, 2 и 3) натощак получали злаковые болюсы с определенными дозами исследуемого средства, а животные контрольной группы получали злаковые болюсы с гелевой основой (плацебо). Аналогично изучению острой токсичности, мониторинг состояния животных по клиническим признакам отмечали в течение 30 дней ежедневно, с контрольными точками на 1-, 10-, 20- и 30-й дни.Учитывая тот факт, что введение средства в дозе 6000 мг/кг массы тела в рамках острого эксперимента не вызвало падежа животных (LD50 не установлена) и в результате данная доза явилась максимальной и единственной, то субтоксические дозы геля «Маклозол» для субхронического эксперимента рассчитывались исходя из данной дозы и составили: 1-я опытная группа (n = 10) 1/10 – 600 мг/кг массы тела; 2-я опытная группа (n = 10) 1/20 – 300 мг/кг массы тела; 3-я опытная группа (n = 10) 1/50 – 120 мг/кг массы тела; контрольная группа (n = 10) – 600 мг/кг (гелевая основа).Средства для оценки токсичности включали стандартные методы и оборудование для измерения физиологических параметров. В каждом эксперименте (острая и субхроническая токсичность) регулярно оценивались масса тела (измерялась с точностью до 0,1 г); активность (оценка уровня активности по шкале, где 0 – отсутствие активности, 3 – высокая активность); наличие диареи или других нарушений со стороны ЖКТ; состояние кожи и шерсти (проверка на наличие покраснений, выпадения шерсти). Показатели крови (эритроциты, лейкоциты, гемоглобин, СОЭ, общий белок, АсАТ, АлАТ, щелочная фосфатаза, глюкоза, мочевина, креатинин, холестерин, кальций, фосфор, билирубин) определялись в рамках субхронического эксперимента. Для этого в последний день клинической части эксперимента у 5 крыс из каждой группы была взята кровь для биохимического анализа (анализатор биохимический Vitalab Flexor Junior с версией программного обеспечения 1.0. (открытая система для проведения фотометрических тестов, изготовитель Vital Scientific N. V. Netherlands. Статистическая обработка количественных результатов проводилась с использованием программного обеспечения фирмы Miсrosoft.Результаты и их обсуждение. Перед началом экспериментов по оценке уровней токсичности в остром и субхроническом эксперименте все животные были помещены в карантин для выявления возможных отклонений от нормальных физиологических параметров, обнаружения скрытых патологий, а также для мониторинга развития патологии. Температура в помещениях вивария варьировала от 20 до 22 °С при относительной влажности 40–60 %. Освещение поддерживалось в режиме день/ночь с двенадцатичасовым периодом освещения лампами дневного света с этапами плавного затухания (1 ч) и двенадцатью часами темноты, что позволило создать комфортную обстановку для поддержания естественных биоритмов животных и снизить стресс. Лабораторные животные находились в стандартных клетках. В качестве подстилки использовались древесные опилки. Животные получали сбалансированное питание, включающее качественные кормовые смеси с необходимыми витаминами и минеральными веществами. В рацион были включены свежие овощи и фрукты, постоянный доступ к чистой и свежей воде. Соблюдение данных условий создало оптимальную среду для пребывания лабораторных крыс в карантине, что обеспечило достоверность результатов токсикологических испытаний.Для принудительного перорального введения препарата «Маклозол» лабораторным крысам готовили суспензию геля индивидуально, исходя из массы тела каждого животного (эквивалентно 6000 мг/кг), посредством диспергирования в дистиллированной воде до достижения объема 5,0 мл. Затем подготовленный препарат в объеме 5 мл однократно вводился крысам натощак после 12 ч голодной диеты с помощью зонда и шприца непосредственно в желудок (рис. 1, 2). Ежедневно проводился регулярный осмотр лабораторных животных на наличие признаков заболеваний или стресса, фиксировались все отклонения в поведении животных и отклонения физиологических показателей от нормальных значений. Результаты испытаний на острую токсичность представлены в таблице 1.   Рис. 1. Зонд и шприц, наполненный суспензией геля «Маклозол»Probe and syringe filled with a suspensionof «Maklozol» gel Рис. 2. Процесс введения образцалабораторным крысам при определенииострой токсичности геля «Маклозол»The process of introducing a sample to laboratory rats in determining the acute toxicityof the Maklozol gel Таблица 1Влияние однократного введения суспензии геля «Маклозол» и гелевой основына физиологические параметры состояния животных в остром эксперименте (M ± m; n = 10)The effect of a single injection of a suspension of «Maklozol» gel and a gel baseon the physiological parameters of the animal condition in an acute experiment (M ± m; n = 10) Параметр1-е сутки7-е сутки14-е суткиОпытная группаКонтрольная группаОпытная группаКонтрольная группаОпытная группаКонтрольная группаМасса тела, г227,5±5,6230,1±3,9229,3±4,1231,8±4,5232,9±5,0233,5±3,5Активность±±++++Аппетит±±++++Наличие диареи и/или нарушений со стороны ЖКТ––––––Состояние кожи и шерсти++++++  В ходе проведенных испытаний, направленных на оценку острого токсического воздействия геля «Маклозол», были получены качественные и количественные данные, анализ которых позволил сделать объективный вывод о токсикологической безопасности исследуемого препарата. В течение 30 мин после введения образцов как в опытной, так и контрольной группе крыс наблюдалось незначительное ухудшение состояния животных, проявляющееся в снижении моторных функций, несколько замедленной реакции на внешние раздражители и общем угнетениии. Это явление было связано с проведением манипуляций и принудительным введением значительного объема геля. Восстановление нормального состояния происходило постепенно, в течение 30–60 мин постоянного наблюдения за опытными объектами. Масса тела лабораторных животных осталась стабильной и не показала значительных достоверных изменений по сравнению с контрольной группой. Оценка уровня активности в последующие дни показала, что все животные демонстрировали стабильную высокую активность на протяжении всего эксперимента. Используемая шкала оценки показала, что большинство животных находились в диапазоне 2–3, что свидетельствует о хорошем самочувствии и отсутствии негативного воздействия на поведение. Наблюдения за состоянием желудочно-кишечного тракта не выявили ни одного случая диареи или других нарушений. Животные сохраняли аппетит и нормальную пищеварительную функцию, что также указывает на отсутствие токсического воздействия геля «Маклозол». Мониторинг состояния кожи и шерсти не выявил никаких отклонений. Все испытуемые животные имели здоровую кожу и шерсть без покраснений или выпадения, летальность отсутствовала, что является прямым подтверждением безопасности препарата.Таким образом, в ходе исследования абсолютная летальная (LD100) и средняя летальная доза (LD50) для геля «Маклозол» не были выявлены, поскольку однократное введение в желудок грызунов препарата в дозе 6000 мг/кг массы тела не привело к проявлениям токсикоза или гибели животных. Увеличение дозировок представлялось нецелесообразным, так как выбранная доза превышала верхнюю границу 4-го класса опасности в соответствии с используемым ГОСТ, и технически было неосуществимо из-за повышения вязкости задаваемого препарата ввиду возрастания концентрации гелеобразующих веществ. Из этого следует, что гель «Маклозол» классифицируется как малотоксичный и по ГОСТ 12.1.007-76 «Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности» относится к 4-му классу опасности (малоопасные вещества).Для проведения субхронического эксперимента ежедневно крысам 1–3 опытных групп проводилась подача злаковых болюсов с исследуемым средством в установленных дозах, а животные контрольной группы получали болюсы с гелевой основой. Осуществлялся визуальный контроль поедаемости. Каждый день проводился осмотр лабораторных животных на наличие признаков заболеваний или стресса, отмечались все изменения в физиологических показателях. Результаты исследования субхронической токсичности геля «Маклозол» зафиксированы в таблицах 2 и 3.  Таблица 2Влияние длительного применения геля «Маклозол» и гелевой основына прирост массы тела лабораторных крыс (M ± m; n = 5)The effect of prolonged use of «Maklozol» gel and gel baseon body weight gain in laboratory rats (M ± m; n = 5) ГруппаМасса тела (г)Прирост массы телана 30-е сутки, %1-е сутки10-е сутки20-е сутки30-е сутки1-я опытная147,9±3,59152,1±3,48156,0±2,99160,3±2,838,42-я опытная149,5±2,55153,9±2,79157,1±2,85162,3±2,408,63-я опытная151,7±3,64155,3±3,51159,9±4,11165,1±3,818,8Контрольная148,0±2,81153,2±2,75157,7±3,63161,2±2,718,9  Подопытные животные потребляли физиологически нормальное количество корма и воды и на протяжении всего месяца при взвешивании 1 раз в десять дней не имели статистически значимых отличий от контрольных крыс по динамике массы тела. Так, по результатам субхронической токсичности в экспериментальных группах 1, 2 и 3 среднегрупповой прирост массы тела за период эксперимента был ниже значений контроля всего на 0,5, 0,3 и 0,1 % соответственно.  Таблица 3 Влияние длительного применения геля «Маклозол» и гелевой основына физиологические параметры состояния животных в субхроническом эксперименте (n = 10)The effect of prolonged use of «Maklozol» gel and gel base on the physiological parametersof animals in a subchronic experiment (n = 10) Параметр1-е сутки10-е сутки20-е сутки30-е сутки123К123К123К123КАктивность++++++++++++++++Аппетит++++++++++++++++Наличие диареи и/или нарушений со стороны ЖКТ----------------Состояние кожи и шерсти++++++++++++++++  В группах, получавших препарат «Маклозол» в форме геля, у 100 % животных не отмечались изменения в поведении (сохраняли адекватную координацию движений и соответствующие реакции на внешние воздействия), потеря аппетита после дачи болюсов не фиксировалась. Так, в течение всего периода клинической части эксперимента у крыс не наблюдалось даже кратковременных изменений в активности и поведенческих реакциях. Не зарегистрированы отклонения функции пищеварительной системы, а также нарушения состояния кожи и шерстного покрова. Контрольная группа, получавшая плацебо, не имела значительных различий с опытными группами ни по одному из оцениваемых критериев. Применение геля «Маклозол» не привело к гибели животных в течение всего периода эксперимента и в течение 10 сут после его завершения.У пяти случайным образом отобранных из каждой группы животных на 30-е сут опыта исследовалась кровь. В таблице 4 приведены данные лабораторного исследования крови крыс, получавших различные дозы препарата, а также значения аналогичных маркеров для крыс контрольной группы, в контексте основных гематологических и биохимических параметров.  Таблица 4Влияние продолжительного использования геля «Маклозол» и гелевой основына показатели крови лабораторных крыс в период проведения субхроническоготоксикологического эксперимента (M ± m; n = 5)The effect of prolonged use of «Maklozol» gel and gel base on rat blood parameters (M ± m; n = 5) Показатель (норма)Группа, препарат1-я опытная:«Маклозол»,600 мг/кг2-я опытная:«Маклозол»,300 мг/кг3-я опытная:«Маклозол»,120 мг/кгКонтроль:гелевая основа,600 мг/кг12345Эритроциты,1012/л 7,9±0,658,1±0,548,0±0,368,2±0,47Лейкоцты,109/л9,5±0,219,7±0,199,4±0,249,9±0,25Гемоглобин, г/л141,3±6,72148,1±5,23143,5±8,56149,4±7,35СОЭ по Панченкову, мм/ч1,7±0,171,9±0,251,6±0,111,7±0,23Общий белок, г/л81,2±1,24*80,9±0,7375,8±1,3676,7±2,19АсАТ, ЕД/л66,3±1,4163,5±2,3161,4±2,1162,8±1,65АлАТ, ЕД/л31,7±0,7630,1±1,6528,4±1,0731,4±0,75Щелочная фосфатаза, ЕД/л754,2±36,80695,37±54,41**729,7±28,93*774,6±38,29Глюкоза, мМ/л7,5±0,638,0±0,728,1±0,557,8±0,74Мочевина, мМ/л6,1±0,116,2±0,146,3±0,255,8±0,10Окончание табл. 412345Креатинин, мкМ/л39,8±0,7141,7±0,6640,1±0,9842,2±0,74Холестерин, мМ/л1,7±0,051,8±0,071,6±0,081,8±0,04Кальций общий, мМ/л2,41±0,092,47±0,132,40±0,152,46±0,11Фосфор неорганич., мМ/л2,20±0,122,28±0,172,24±0,172,23±0,19Билирубин общий, мкМ/л8,8±0,549,1±0,328,5±0,478,7±0,41Примечание. Степень достоверности к контролю: *р ≤ 0,05; **р ≤ 0,01.  Биохимические анализы крови в конце эксперимента не показали значительных отклонений по сравнению с контрольной группой, что свидетельствует о безопасности препарата при длительном применении. Эритроциты и лейкоциты находились в норме во всех группах, показывая стабильное состояние здоровья (различия между группами несущественны). Гемоглобин у животных опытных групп ниже (максимальная разница в 1-й опытной группе – 5,7 %), чем у контрольной группы, но находится в пределах видовой нормы (от 141,3 до 148,1 г/л), что указывает на отсутствие анемии. СОЭ низкая, что свидетельствует об отсутствии воспалительных процессов. Показатели общего белка в опытных группах варьируют от 75,8 до 81,2 г/л, выше в 1-й и 2-й опытных группах (на 5,9 и 5,5 % соответственно выше контроля), что может указывать на активизацию белкового обмена в данных группах. В уровне трансаминаз (АлАТ и АсАТ) не зафиксированы значимые различия с контрольной группой. Показатели глюкозы, холестерина, мочевины и креатинина находятся в норме, что подтверждает отсутствия нарушений в обмене веществ и функции почек. Уровень щелочной фосфатазы соответствует возрасту крыс и ниже в опытных группах. Значения таких жизненно важных макроэлементов, как кальций и фосфор, во всех группах соответствуют видовой и возрастной норме и не имеют существенных различий между опытными и контрольными группами. Нарушений в пигментном обмене, выраженном в определении уровня общего билирубина, не установлено ни в одной группе. Диагностически значимых изменений в количестве лейкоцитов в крови крыс опытной и контрольной групп не установлено.Заключение. По результатам определения токсичности нового ранозаживляющего геля «Маклозол» в остром и субхроническом эксперименте было выявлено, что препарат не проявляет системного токсического действия на организм лабораторных крыс и не оказывает отрицательного влияния на основные функциональные системы организма при длительном применении в субтоксических дозах. Гель «Маклозол» был классифицирован как малотоксичный и отнесен к 4-му классу опасности (ГОСТ 12.1.007-76 «Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности»).