Введение. Сыр – это богатый питательными веществами продукт, содержащий основные питательные вещества, белки, жиры, витамины и минералы, он играет важную роль в удовлетворении питательных потребностей человека при соблюдении меры. Производство твердых и полутвердых сыров включает фазу созревания, которая может длиться разное время. Созревание является сложным процессом, который включает различные биохимические изменения: гидролиз липидов, метаболизм лактозы, распад белка в сочетании с микробиологическими изменениями [1, 2]. Основным катализатором этих превращений служат заквасочные микроорганизмы, а также собственная микробиота молока, молочные ферменты, коагулянты и вторичные микроорганизмы, такие как плесень и дрожжи. В процессе сыроварения могут быть использованы различные заквасочные культуры, но особо популярны закваски на основе Lactococcus lactis ssp. lactis, Lc. lactis ssp. cremoris, Streptococcus thermophilus и Lactobacillus helveticus (FD-DVS RSF-736, Chr.Hansen A/S, Hørsholm, Дания) с некоторыми с модификациями [3]. В процессе созревания сыра молочные белки подвергаются ферментации молочнокислыми бактериями, в результате которой образуются различные биоактивные пептиды, в т. ч. пептиды-ингибиторы ряда ферментов, иммуномодулирующие пептиды, антимикробные и антиоксидантные пептиды [4]. На уровне геномных исследований в подавляющем большинстве случаев сыров, имеющих стадию созревания, наблюдается следующая тенденция. В сырах молочнокислые бактерии, используемые в качестве закваски, при созревании постепенно заменяются на незаквасочные молочнокислые бактерии, в основном на мезофильные лактобактерии, лейконосток, педиококки и энтерококки, источником которых является используемое молоко, а также среда и инвентарь сыродельни. Эти микроорганизмы в разной степени присутствуют в жизнеспособной микробиоте сыров во время созревания за счет их способности использовать, помимо остаточной лактозы, другие доступные питательные вещества, такие как пентозы, углеводы из гликозилированных пептидов κ-казеина и мембран жировых глобул, цитрат, пептиды и аминокислоты [5].В современном тренде сыроделия все чаще звучит идея использования сыра как матрицы введения в рацион человека пробиотических бактерий [6–8]. Сыр может считаться эффективным средством доставки пробиотических микроорганизмов в организм человека из-за ряда преимуществ по сравнению с другими ферментированными молочными продуктами. В отличие от йогурта, который имеет более низкий уровень pH (~4,0–4,5), у сыра этот показатель обычно выше (~5,0–5,5), что создает более благоприятные условия для выживания пробиотиков как в самом продукте, так и при прохождении через желудок человека [9]. Многие пробиотики являются анаэробными или микроаэрофильными (например Lactobacillus и Bifidobacterium), поэтому плотная структура сыра ограничивает воздействие кислорода, повышая жизнеспособность полезных бактерий. Молочные жиры в сыре могут инкапсулировать клетки пробиотиков, защищая их от агрессивной среды желудка и улучшая их выживаемость в кишечнике [10]. В процессе своего развития в сыре пробиотические лактобактерии выделяют множество продуктов метаболизма, положительно влияющих на функциональное состояние человека [11].  Помимо повышения полезных свойств пищевых продуктов пробиотические лактобактерии могут выполнять защитную функцию в сыре, предотвращая развитие Aspergillus flavus и Aspergillus niger и соответственно накопления афлотоксинов [12]. В дополнение у штамма L. rhamnosus выявлена способность ингибировать рост патогенного L. monocytogenes в сыре [13]. Таким образом, актуальность изучения пробиотических штаммов российской селекции на качественные показатели сыра очень высока и имеет широкую перспективу развития.Цель исследования – изучить влияние незаквасочного пробиотического штамма Lactiplantibacillus plantarum FCa3L на комплекс показателей качества полутвердого сыра. Задачи: оценка сыров, изготовленных с классической закваской и закваской, в которую добавлен пробиотический штамм, по следующим параметрам: химические, структурно-механические, органолептические и антиоксидантные.Объекты и методы. Влияние штамма Lactiplantibacillus plantarum FCa3L (ранее этот штамм был описан как пробиотический [14]) изучали в модели полутвердого сыра. Изготовление сыра проводили по ранее описанному методу [15]. Использовали сырое коровье молоко со следующими характеристиками: 3,3 % белка; 4 % жира; 4,15 % лактозы, данные получены с помощью «Клевер-2М» (Россия). Предварительно пастеризованное молоко (75 °C, 30 с) охлаждали до 40 °C, добавляли заквасочную культуру CHOOZIT™ (Danisco, Франция), пробиотический штамм L. plantarum FCa3L (варианты сыров приведены в табл. 1), оставляли на ферментацию на 60–90 мин.  Таблица 1Рецептура сыра полутвердогоSemi-hard cheese recipe Компонент рецептурыКонтрольL. plantarum FCa3LСырое коровье молоко, л44Жидкая коммерческая закваска CHOOZIT™, мл5–Жидкая закваска L. Plantarum, мл–5Коммерческая закваска CHOOZIT™, г0,070,07Жидкий сычужный фермент, мл0,120,12Раствор хлорида кальция (10 %), мл44  После ферментации и снижении рН на 0,2 ед., добавляли сычужный фермент (50000 ед.) (ООО «Современные технологии», г. Радужный, Россия). Смесь оставляли для коагуляции при температуре 35 °C на 40 мин, затем молоко оставляли в покое до образования прочного сгустка. Получившийся сгусток разрезали стерильным творожным ножом на кусочки размером 1 × 1 × 1 см, полученную массу оставляли в покое на 15–30 мин, затем отделяли сыворотку. Зерно перекладывали в формы, самопрессовали в течение 2 ч, затем прессовали под давлением, ставили отдыхать в холодильник на 12 ч. Сыры извлекали из форм, посол осуществляли в рассоле и далее отправляли на созревание в течение 45 дней при температуре 12 °C, влажности воздуха 75–80 %, анализ качества сыра проводили через 3 дня и далее каждые две недели.Химический состав сыра, цветность определяли как описано ранее [15]. Органолептическая оценка сыра проводилась через 45 дней после созревания. Сыры разрезали на кубики размером ~2 × 2 × 2 см3. Затем образцы помещали на пластиковые тарелки и кодировали случайными двузначными номерами. Гедонистическая оценка проводилась нетренированной и некурящей группой из 20 испытуемых (10 мужчин и 10 женщин, возраст от 19 до 65 лет), просили описать вкус, запах и текстуру сыра.Приготовление водного экстракта и безбелкового экстракта. Образцы сыра (1 г) гомогенизировали в 10 мл дистиллированной воды, суспензию оставляли на 1 ч при 4 ºС, затем фильтровали через бумажный фильтр и использовали для анализа как водный экстракт (ВЭ). Для получения безбелкового экстракта (ББЭ) в 5 мл водного экстракта добавляли 0,2 мл 90 % трихлоруксусной кислоты, выдерживали 5 мин, потом центрифугировали 8000 об/мин 10 мин при комнатной температуре, супернатант собирали и использовали для анализа.Суммарные фенольные соединения (СФС) в водном экстракте (ВЭ) и ББЭ определяли с помощью реактива Фолина-Чиокальтеу. Для этого 250 мкл образца добавляли к 250 мкл реагента Фолина-Киокальтеу, через 10 мин добавляли 1,25 мл раствора карбоната натрия (5 %) и 0,75 мл чистой воды и перемешивали. Затем смесь инкубировали в течение 1 ч в темноте и измеряли абсорбцию при 750 нм с помощью спектрофотометра (СФ-2000, Россия). Результаты выражали в тирозиновых эквивалентах, мкг/мл.Анализ концентрации пептидов осуществляли с помощью O-фтальдиальдегидного анализа (OPA): ББЭ (100 мкл) смешивали с 1,0 мл раствора реагента OPA (ThermoScientific, США) и инкубировали в течение 2 мин. Абсорбцию измеряли при 340 нм (спектрофотометр СФ-2000, Россия).Оценка радикал-связывающей активности. Для анализа 1 мл образца (водный экстракт или безбелковый экстракт) смешивали с 1 мл свежеприготовленного 0,12 мМ раствора 2,2-ди-фенил-1-пикрилгидразила (ДППГ) в этаноле. Реакционные смеси инкубировали при комнатной температуре в темноте в течение 30 мин. Смеси центрифугировали в течение 2 минут при 10000 об/мин.  Поглощение супернатанта измеряли при 517 нм с помощью спектрофотометра СФ-2000 (Россия). Активность поглощения радикалов рассчитывали по следующему уравнению:Ингибирование, % = [(абсорбция контроля – абсорбция образца)/(абсорбция контроля)] · 100 %.Оценка гидроксил-радикал-связывающей активности. Для анализа 0,5 мл образца (водный экстракт или безбелковый экстракт) смешивали с 0,5 мл дистиллированной воды, затем приливали 1 мл образца, добавляли 1 мл 5 мМ/л раствора сульфата железа (FeSO4), 1 мл 5 мМ/л раствора салициловой кислоты в этаноле, 1 мл 0,03 % раствора перекиси водорода, затем перемешивали и инкубировали при 37 °C в течение 30 мин, центрифугировали 5 мин при 9000 об/мин и отбирали надосадочную жидкость. Поглощение супернатанта измеряли при 510 нм с помощью спектрофотометра СФ-2000 (Россия). Активность поглощения радикалов рассчитывали по следующему уравнению:Ингибирование, % = [(абсорбция контроля – абсорбция образца)/(абсорбция контроля)] · 100 %.Определение восстанавливающей активности. 1 мл исследуемых образцов (водный экстракт или безбелковый экстракт) смешивали с 1 мл 0,2 М K-Na фосфатного буфера (рН 6,5) и 1 мл 1 % феррицианида калия. Реакционную смесь инкубировали 20 мин при 50 °С, охлаждали, после чего добавляли 1 мл 10 % трихлоруксусной кислоты. Смесь центрифугировали при 7000 г 5 мин при комнатной температуре. К супернатанту (1 мл) добавляли 1 мл дистиллированной воды и 200 мкл 0,1 % FeCl3. Абсорбцию реакционной смеси измеряли при 700 нм с помощью спектрофотометра СФ-2000 (Россия).Анализ текстуры проводился в соответствии с [16], с некоторыми изменениями. Сыр нарезали кубиками размерами 1 × 1 × 1 см. Текстурный профиль определяли при температуре (25 ± 1) °C с помощью текстурометра «Структурометр СТ-2» и программного обеспечения ST-Data-TPA (ООО «Лаборатория качества», Россия). Испытание проводили с помощью цилиндрического зонда диаметром 36 мм, который внедрялся в исследуемые образцы. Было произведено 2 цикла погружения зонда со скоростью 0,5 мм/с. Образцы сжимали на 50 % от первоначальной высоты.В ходе анализа были измерены твердость (пиковая сила, возникающая при первом сжатии), упругость (отношение расстояния, на которое поднимается поршень при втором сжатии, к исходному расстоянию сжатия), когезия (отношение площадей второго и первого сжатий) и пережевываемость (произведение твердости, упругости и когезии).Результаты и их обсуждение. В работе изучали влияние незаквасочного штамма Lactiplantibacillus plantarum FCa3L в составе сырной закваски на комплекс показателей, в том числе отражающих активность штамма в условиях молочного сырья в технологии полутвердого сыра. Выявлено, что уже на стадии ферментации молока добавление L. plantarum FCa3L приводит к более интенсивному накоплению молочной кислоты, на протяжении 2 ч ферментации показатель рН в варианте +FCa3L был на 0,2 ед. меньше, чем в контроле (рис. 1). В процессе созревания эта тенденция сохранилась, в течение 45 дней рН в экспериментальном варианте был ниже.     Рис. 1. Изменения рН молока в процессе ферментации (А) и динамика рН сыра в процессе созревания (Б)Changes in milk pH during fermentation (A) and cheese pH dynamics during ripening (Б)  Анализ химических показателей выявил более активное накопление молочной кислоты в образце +FCa3L в процессе созревания, что свидетельствует об отсутствии ингибирования кислотообразования всей закваски в присутствии L. plantarum FCa3L (табл. 2). Влажность сыров при закладке на созревание различалась, в варианте с L. plantarum FCa3L она была выше на 2 %. Через 14 сут, как и следовало ожидать, количество влаги резко уменьшилось, причем в варианте с L. plantarum FCa3L это уменьшение более значимое, чем в контроле. На всем протяжении созревания контрольный сыр постепенно отдавал воду, чего не скажешь о варианте +FCa3L. Изменение количества жира было обратно пропорционально количеству влаги, что ожидаемо. Общее содержание белка при созревании в обоих случаях практически не изменялось. Надо заметить, что вариант +FCa3L лучше просолился, о чем свидетельствует большая концентрация соли в сыре. Таблица 2Химические показатели сыров в процессе созревания The chemical parameters of cheeses during the ripening process Вариант сыраСрок созревания, сутМолочная кислота, %Белок, %Жир, %Влажность, %Соль, %Глюкоза, мкМ/л12345678Контроль38,23526,08531,8639,9892,46612,25108,14526,17335,94535,9151,96712,75308,87525,67039,16033,0892,08113,50458,74026,37839,87631,6092,13713,59Окончание табл. 212345678+FCA3L38,50526,42229,17341,7272,67813,63108,73025,85738,62433,0152,50413,75308,91026,32339,86631,5312,28014,00459,27026,46739,68230,9752,87613,75  Анализ пептидов, как показателей протеолитической активности, показал, что добавление в закваску штамма FCa3L увеличивает гидролиз белков под действием бактериального консорциума с образованием низкомолекулярных продуктов (рис. 2, А). Особенно активное накопление пептидов было в период первых 14 сут, в дальнейшем в варианте сыра с FCa3L наблюдалось снижение этого показателя. Такой ход кривой свидетельствует об активных микробных процессах включения продуктов гидролиза белков в метаболические пути. Что касается контроля, то здесь наблюдалось накопление пептидов через 14 сут, с дальнейшей стабилизацией этого показателя. Минимальное изменение количества пептидов в процессе созревания, видимо, является следствием снижения численности заквасочных бактерий.    Рис. 2. Изменения количества пептидов в безбелковом экстракте (ББЭ) (А) и количества фенолсодержащих соединений в водном экстракте (ВЭ) и ББЭ (Б) в процессе созревания сыраChanges in the level of peptides in protein-free extract (PFE) (A) and the level of phenolic compounds in water extract (WE) and PFE (Б) during cheese ripening process  Добавление в состав закваски пробиотического штамма FCa3L приводило к увеличению суммарного количества фенольных соединений в водном и безбелковом экстракте (рис. 2, Б), этот показатель служит индикатором присутствия соединений с ароматической группой, обладающих антиоксидантными свойствами.В процессе созревания были выявлены отличия структурно-механических свойств между образцами. Прежде всего сырное зерно, формируемое при созревании, в варианте с FCa3L отличалось большей влагоудерживающей способностью (рис. 3, А). Кроме того, сырное зерно в варианте +FCa3L было способно больше сорбировать добавленную воду (рис. 3, Б). Таким образом, добавление в закваску пробиотического штамма позволяет формировать одновременно сырную матрицу с повышенной сочностью за счет остаточной воды и способности вбирать дополнительно влагу извне.Текстурные характеристики образцов сыра значимо отличались (рис. 4), эти отличия формировались по мере созревания сыров. Показатель твердости резко вырос на 14-е сут созревания как в контрольном, так и в опытном образце. В процессе дальнейшего созревания, к 28-м сут, твердость обоих образцов понизилась, а на 42-е сут созревания этот показатель опять увеличился как в контрольном, так и в опытном образце. Следует отметить, что на 3-и сут созревания твердость была выше у контрольного образца, а начиная с 14-х сут созревания твердость была выше у опытного образца.    Рис. 3. Изменения влагоудерживающей (А) и влагосвязывающей (Б) способности сыра в процессе созреванияChanges in water-holding (A) and water-binding (Б) capacity during cheese ripening process  Похожая картина наблюдалась при анализе показателя пережевываемости. Пережевываемость опытного образца на 3-и сут была существенно ниже контрольного, однако на 14-е и 28-е сут созревания разница в этом показателе уже не была столь значительной, а на 42-е сут пережевываемость опытного образца стала выше, чем у контрольного.Показатели упругости и когезии постепенно снижались в течение всего срока созревания, причем значения этих показателей у опытного образца были ниже по сравнению с контрольным. Следует отметить, что в контрольном образце снижение значений как упругости, так и когезии происходило более интенсивно.    Рис. 4. Изменения показателей текстурного профиля сыров в процессе созревания: А – твердость; Б – упругость, В – когезия; Г – пережевываемостьChanges in the textural profile of cheeses in the process of ripening:A – hardness; Б – elasticity, В – cohesion, Г – chewiness  Органолептическая характеристика сыров была различна, корка у обоих образцов была прочная, ровная, без повреждений. Консистенция различалась: если у контроля тело сыра было умеренно эластичным, то в варианте с FCa3L оно было более плотным. На разрезе у обоих образцов были глазки неправильной формы, в контроле они располагались равномерно по всей толще, а в варианте с FCa3L менее равномерно. Вкус сыра в варианте с FCa3L был более острый, насыщенно сырный, тогда как в контроле выраженный сырный вкус чуть кисловатый. Цвет образцов различался, сыр с пробиотиком был более темный, что подтверждается и инструментальным анализом (рис. 5), показатель L (белизны) меньше в сыре FCa3L, кроме того, показатель a в варианте FCa3L более стабилен при созревании и не стремится к 0. Показатель b не подвержен флуктуациям при созревании, формируется устойчивая желтая окраска, тогда как в контроле интенсивность желтизны больше к концу созревания.    Рис. 5. Изменения цветовых характеристик сыра в процессе созревания: A – L показатель белизны (+)белый/(–)черный; Б – (+)краснота/(–)зеленость; В – (+)желтизна/(–)голубизнаChanges in color characteristics of cheese during ripening: A – L indicator of whiteness (+)white/(–)black; Б – (+) redness/(–)greenness; В – (+)yellowness/(–)blueness  Антиоксидантные свойства кисломолочных напитков обеспечиваются различными продуктами метаболизма: аминокислотами, биоактивными пептидами, которые высвобождаются из α-лактальбумина, β-лактоглобулина и α-казеина в процессе ферментации, вновь синтезированными пептидами [17, 18]. Учитывая процессы молочнокислого брожения, протеолиза, протекающих в сыре, можно предположить, что сыр содержит в своем составе компоненты с антиоксидантными свойствами. В исследовании проводили анализ безбелкового экстракта и водного экстракта сыра (рис. 6), такое разделение дало возможность оценить отдельно вклад низкомолекулярных пептидов. Радикалсвязывающая активность низкомолекулярных соединений в ББЭ на протяжении почти всего процесса созревания была выше в варианте с FCa3L. При этом этот показатель не отличался при анализе водного экстракта, что, видимо, обусловлено большим вкладом в реализацию связывания радикалов экстрагируемых молочных белков.Гидроксил-радикалсвязывающая активность компонентов ББЭ в варианте сыра FCa3L была на всем протяжении созревания выше, тогда как в водном экстракте выявлены значительные флуктуации. Возможно, за реализацию способности связывать гидроксил-ионы отвечают группы веществ в сырном матриксе, претерпевающие преобразования под действием молочнокислых бактерий. Восстановительная сила ББЭ и водного экстракта как контрольного, так и опытного варианта сыров не отличалась на всем протяжении созревания.Активное использование пробиотиков в технологии кисломолочных напитков является катализатором расширения ассортимента продуктов, в технологии которых могут быть использованы пробиотические бактерии. В настоящей работе была продемонстрирована возможность использования штамма L. plantarum FCa3L [19] с целым рядом пробиотических свойств в технологии полутвердого сыра. Штамм L. plantarum FCa3L не влияет на общее содержание основных пищевых веществ в сыре. Однако выявлены изменения накопления продуктов протеолиза в варианте сыра с добавлением L. plantarum FCa3L. В ранний период созревания наблюдается усиленное накопление низкомолекулярных пептидов в сыре FCa3L. Аналогичные результаты были получены исследователями при использовании Lactobacillus helveticus в чеддере [20]. Кроме того, выявлено повышенное накопление фенолсодержащих соединений как продуктов гидролиза молочных белков, так и продуктов метаболизма МКБ в экспериментальном варианте. Роль пептидов, продуктов метаболизма МКБ в формировании полезных свойств кисломолочных продуктов обсуждается во многих работах [20, 21]. В наших исследованиях выявлен больший антиоксидантный потенциал в варианте с L. plantarum FCa3L, что коррелирует с большей интенсивностью накопления продуктов протеолиза.    Рис. 6. Изменения антиоксидантных свойств сыров в процессе созревания:А, Б – радикалсвязывающая активность; В, Г – гидроксил-радикал-связывающая активность;Д, Е – восстанавливающая активность; А, В, Д – безбелковый экстракт,Б, Г, Е – водный экстрактChanges in antioxidant properties of cheese in the ripening process:A, Б – radical-scavenging activity; В, Г – hydroxyl-radical-scavenging activity;Д, Е – reducing activity; A, В, Д- protein-free extract; Б, Г, Е – water extract  Интересным является факт изменения текстуры сыра, если в состав закваски интродуцирован L. plantarum FCa3L. Показатель твердости указывает на требуемое усилие для деформации твердого тела. Применительно к сырам этот показатель связан с влажностью продукта. Влага в сыре служит своеобразным связующим звеном, обеспечивая молекулам возможность свободного перемещения относительно друг друга, и способствует мягкости и пластичности продукта [22]. Высокие значения влажности в начальный период созревания обуславливают низкие значения твердости, и наоборот, по мере снижения влажности при дальнейшем созревании твердость сыров увеличивалась. Снижение когезии и упругости в процессе созревания может быть связано с протеолизом белковых молекул, а также с накоплением молочной кислоты. По мере увеличения протеолиза или снижения рН целостность и сцепление мицелл казеина в сыре нарушаются [23]. Кроме того, имеются сведения, что по мере ослабления связей внутри белковой матрицы увеличивается взаимодействие белков с влагой [24]. Это в свою очередь приводит к ослаблению структурных связей между частицами сыра и снижению когезии.Принимая во внимание полученные в процессе комплексного исследования результаты, можно говорить о положительной роли пробиотического штамма L. plantarum FCa3L в составе закваски для полутвердых сыров. Высокие технологические параметры полученного сыра в совокупности с показанными ранее высокими антагонистическими свойствами L. plantarum FCa3L по отношению к патогенным бактериям делает перспективным применение этого штамма в сыроделииЗаключение. Проведенное исследование продемонстрировало, что добавление пробиотического штамма Lactiplantibacillus plantarum FCa3L в закваску для полутвердого сыра оказывает значительное влияние на его качественные и функциональные характеристики. Было установлено, что штамм FCa3L способствует более интенсивному кислотообразованию, что подтверждается снижением pH на всех этапах созревания. Кроме того, наблюдалось увеличение протеолитической активности, что привело к накоплению низкомолекулярных пептидов и фенольных соединений, обладающих антиоксидантными свойствами. Текстурные свойства сыра также изменились: образец с FCa3L показал более высокую твердость и пережевываемость, что связано с улучшенной влагоудерживающей способностью сырной матрицы. Органолептическая оценка выявила более насыщенный вкус и устойчивый цвет у сыра с пробиотиком. Антиоксидантная активность, особенно в безбелковом экстракте, была выше в варианте с FCa3L, что подтверждает его потенциал в улучшении функциональных свойств продукта. Таким образом, использование штамма L. plantarum FCa3L в технологии полутвердого сыра не только сохраняет традиционные показатели качества, но и обогащает его пищевую ценность за счет увеличения содержания биоактивных компонентов. Полученные результаты открывают перспективы для дальнейшего изучения пробиотических штаммов в сыроделии и разработки новых функциональных продуктов.