Введение. На современном этапе развития общества сохранение биоразнообразия растений является глобальной проблемой, так как изменение климата, экологические катастрофы, войны и антропогенное воздействие приводят к уничтожению растительного генофонда и наносят невосполнимый урон биологическому разнообразию Земли.Микроклональное размножение широко используется в разных странах для создания высококачественного посадочного материала различных сельскохозяйственных культур, тем самым эффективно способствуя развитию сельского хозяйства в настоящее время и в обозримом будущем. Благодаря применению данного метода, появилась возможность создания банков in vitro редких и ценных генотипов растений [1−3].При хранении коллекций in vitro в оптимальных условиях (t = 20–25 °С) возникает необходимость частого переноса растений на свежую питательную среду, что повышает стоимость хранения образца и увеличивает риск его инфицирования. Кроме того, частое пассирование микропобегов стимулирует активное деление клеток, что может приводить к возникновению сомаклональных вариантов.Хранение в условиях минимального роста − один из самых эффективных способов содержания коллекций [4−6]. Главный методический подход к депонированию растений in vitro − достижение состояния максимально замедленного метаболизма, способного поддерживать жизнеспособность растительных тканей.Замедление роста обычно достигается за счет модификации сред [7] или условий культивирования. Наиболее часто для сохранения растений в коллекции применяют пониженные положительные температуры [8], снижение интенсивности освещения, уплотняют питательную среду путем повышения в ней содержания агара [9]. Для торможения роста растений помимо этого в питательную среду добавляют осмотики сорбит [10], манит, ретарданты (например хлорхолинхлорид), гормоны (регуляторы роста) и др. [11]. Следует отметить, что во всех рассмотренных способах продолжительность беспересадочного хранения увеличивается практически вдвое и составляет около 12 месяцев. Однако биологические особенности растений позволяют более продолжительное беспересадочное хранение растений − до 2−3 лет [12].Известна возможность получения растений in vitro с вызревшей лозой [13]. Авторы отмечают, что теоретически растения с вызревшей лозой in vitro (микросаженцы) можно в течение нескольких лет хранить плотно упакованными в ящиках без освещения при температуре 1−7 °С, перевозить на большие расстояния и создавать коллекцию сортов. Однако это не подтверждено фактическими данными.Цель исследования – разработка способа создания коллекции генофонда винограда in vitro при совместном применении биотехнологических методов: модификации питательной среды и культивировании растений в условиях пониженной положительной температуры.Задачи: разработка длительного (до 2−3 лет) депонирования растений винограда in vitro с вызревшей лозой, позволяющего за счет увеличения продолжительности беспересадочного хранения, сокращения трудозатрат и исключения дорогостоящих реактивов повысить экономическую эффективность хранения генофонда винограда in vitro и обеспечить сохранность генетической стабильности образцов.Материалы и методы. Исследование проводили по общепризнанным в биотехнологии методикам на классических, донских аборигенных, подвойных сортах и сортах винограда селекции института в стационарных лабораторных условиях в период 2014−2021 гг.Для опытов отбирали растения, регенерированные из апикальных меристем размером 0,1–0,2 мм и размноженные в культуре in vitro. В операционной комнате в ламинарном боксе «Фортран» осуществляли микрочеренкование растений. Длина микрочеренка: 10–12 мм, 1−2 мм над глазком, остальная под глазком.Полученные микрочеренки высаживали по одному в пробирку на твердую питательную среду Мурасиге и Скуга следующего состава мг/л: макроэлементы: NH4NO3 – 138, KNO3 – 950, MgSO4 · 7H2O (MgSO4 · 5H2O) – 185, KH2PO4 – 68, CaCl2 · 2H2O – 166; микроэлементы: H3BO3 – 6,2, MnSO4 · 4H2O (MnSO4 · 5H2O) − 22,3, СuSO4 · 5H2O − 0,025, CoCl2 · 6H2O − 0,025, ZnSO4 · 7 H2O − 8,6, Na2MoO4 − 0,25, KJ − 0,83; хелат железа: железо сернокислое 7-водное (FeSO4 · 7Н2O) – 27,8, трилон-Б-Na2ЭДТА – 37,3; витамины: мезоинозит – 50, тиамин HCl – 0,2; ИУК – 0,1–3 мг/л; рН среды перед автоклавированием – 5,7−5,9 (рис. 1).Культивирование осуществляли в культуральной комнате при освещенности 3,0 тыс. люкс, фотопериоде 16/8 ч, температуре 25–27 ± 2 °С, влажности воздуха 70–75 %.Повторность опыта 3-кратная, в каждой повторности по 14 растений.Показатели, учитываемые при регенерации и сохранении растений: приживаемость, гибель от инфекции, гибель из-за отсутствия развития, число корней, длина корней, средняя длина корня, ризогенная зона, высота растений, количество листьев всего и на 1 см побега, скорость роста, коэффициент полярности.Жизнеспособность растений оценивали по количеству некрозов тканей листьев и побегов: 0 баллов – визуальная гибель растения; 1 балл – некроз более 50 % тканей растения; 2 балла – некроз менее 50 % тканей; 3 балла – растения без некроза.Результаты и их обсуждение. Установлено, что в процессе культивирования происходит вызревание побегов растений в пробирках, которое зависит от содержания сахарозы в составе питательной среды. Наибольшее число растений сорта Баклановский с вызреванием побегов выявлено при концентрации сахарозы 50−60 г/л (табл. 1). Таблица 1Показатели вызревания in vitro растений сорта Баклановский при различном содержании сахарозы в составе питательной среды (2014 г.) Сахароза,г/лПродолжительностьхранения, днейВызревших растений, шт.Длина вызревшей части побегов, см20,033016,030,033022,540,033035,350,033065,560,033014,0  Рис. 1.  Вызревание растений сорта Сибирьковый в процессе хранения  Вызревание лозы произошло и при культивировании растений сортов Крестовский и Сибирьковый (табл. 2). Лучшее вызревание выявлено при концентрации сахарозы 60,0 г/л, что позволило получить 140 одноглазковых микрочеренков. Этого количества достаточно для регенерации растений, массового их тиражирования и перезакладки коллекции.  Таблица 2Число вызревших микрочеренков при продолжительном культивировании растений в зависимости от содержания сахарозы в питательной среде (2011−2012 гг.) СортКонцентрация сахарозы, г/л102030405060ВсегоКрестовский––9–47386Сибирьковый––1361667102По двум сортам––22620140188  В процессе продолжительного беспересадочного хранения пробирочных растений на питательной среде с повышенными концентрациями сахарозы (50−60 г/л) появлялась осенняя окраска листьев и происходило вызревание побегов у 11 различных сортов винограда (табл. 3).  Таблица 3Показатели вызревания побегов некоторых сортов виноградапри содержании сахарозы в питательной среде 60,0 г/л СортПродолжительность хранения, днейВызревшихрастений, шт.Длина вызревшей части побегов, смСыпун черный300113,9Виерул300114,0Цимлянский черный (2-3)30083,4Кумшацкий30055,1Цимладар30052,4Баклановский30034,2Каберне Совиньон33065,3Кумшацкий33064,8Рупестрис дю Ло33063,6Красностоп золотовский33042,6Сибирьковый33023,0 Факт вызревания побегов в условиях депонирования является положительным для создания коллекции. Вызрело по 11 растений сортов Сыпун черный и Виерул, 8 растений сорта Цимлянский черный (клон 2-3), по 5−6 растений сортов Каберне Совиньон, Кумшацкий, Рупестрис дю Ло, Цимладар. Более слабое вызревание отмечено у растений сортов Красностоп Золотовский, Баклановский, Сибирьковый. Таблица 4Показатели жизнеспособности растений различных сортов при хранении их на питательной среде с содержанием сахарозы 70,0 г/л (2013 г.) СортСохранилось, шт/%Высота, смЛистьев, шт.Жизнеспособность, баллызеленыхпожелтевшихсухихХранение в течение 159 днейЦимлянский черный (клон 2-3)19/67,89,85,62,32,51,9Косоротовский18/64,27,55,82,42,82,1Кукановский9/32,19,05,51,93,62,1Сибирьковый15/53,67,84,82,03,11,9Рупестрис дю Ло9/32,15,24,41,01,02,0Хранение в течение 247 дней Цимлянский черный (клон 2-3)17/60,710,43,72,44,01,1Косоротовский17/60,78,64,14,92,91,1Кукановский9/32,19,73,03,04,01,1Сибирьковый7/25,08,85,53,15,51,0Рупестрис дю Ло7/25,05,74,01,92,51,1Хранение в течение 263 дней Косоротовский7/25,0–3,74,65,01,0Кукановский7/25,0–2,04,06,61,0Сибирьковый7/25,0–3,02,77,01,0Рупестрис дю Ло4/14,2–3,52,52,51,2Цимлянский черный (клон 2-3),0сухие02,07,30          Пониженная положительная температура – фактор, замедляющий ростовые процессы. В связи с этим дополнительно к культивированию при повышенном содержании сахарозы осуществляли хранение вызревших пробирочных растений в фармацевтическом шкафу при пониженной положительной температуре 1−8 °С. Растения хранились в плотно закрытых пробирках с твердой питательной средой.Вызревшие растения хранили в течение года в фармацевтическом шкафу, а затем они были расчеренкованы и высажены на свежую питательную среду. Выявлено, что микрочеренки сохранили регенерационную способность. Таким образом, установлена возможность регенерации in vitro растений из вызревших микрочеренков, что способствует продлению сроков беспересадочного хранения.В фармацевтическом шкафу в течение 1 года хранили вызревшие растения сортов Памяти Кострикина, Виерул, Феркаль, Рупестис дю Ло, SO4, в течение 2 лет – растения сортов Крестовский и Сибирьковый, в течение 3 лет – растения сортов Денисовский, Сибирьковый, Фиолетовый ранний, 4 года хранили растения сортов Баклановский, Виерул, Сыпун черный, Цимладар, Сибирьковый (рис. 2). Характеристика их состояния представлена в таблице 5.    Рис. 2. Хранение растений в фармацевтическом шкафу Таблица 5Показатели состояния растений после хранения при температуре 8 °С в течение 3–4 лет СортДлительность хранения, летРастенийс вызреванием, шт.Высотарастений, смВызревание побеговсм%Межвидовые сортаБаклановский4810,74,049,9Виерул4810,47,067,8Денисовский3314,610,370,3Фиолетовый ранний337,34,360,9Аборигенные донские сорта виноградаСибирьковый31,011,06,054,5Сыпун черный411,09,45,864,1Цимладар466,9468,9Цимлянский черный (клон 2-3)459,75,355,0Подвойный сортРупестрис дю Ло366,34,367,7         Растения после хранения были одревесневшими с различной степенью вызревшей части. Среда в пробирках не высохла. Длина вызревшей части, как это следует из данных таблицы 5, колебалась от 49,8 до 70,3 %. Лучшее вызревание по сравнению с аборигенными отмечено у межвидовых сортов винограда. Вызревание у подвоев также было высоким. У сортов Виерул и Рупестрис дю Ло оно составило 67,8−67,8 %. Более значительное вызревание отмечено у сортов Фиолетовый ранний и Денисовский. Среди аборигенных сортов винограда по степени вызревания выделился Цимладар.Растения сортов Баклановский, Виерул, Фиолетовый ранний, Денисовский, Сыпун черный, Цимладар и Цимлянский черный были расчеренкованы. Одревесневшие микрочеренки с живыми тканями были высажены на твердую питательную среду Мурасиге и Скуга.Учет, проведенный через месяц, показал, что произошла единичная регенерация побегов у сортов Баклановский, Сыпун черный. Кроме этого, отмечено образование побега без корней у сорта Фиолетовый ранний, корней (4 шт.) у сорта Цимладар. У остальных одревесневших микрочеренков развитие отсутствовало. Состояние регенерации растений представлено в таблице 6. Таблица 6 Показатели регенерации растений в стандартных условиях культивирования (30 дней) после 3−4 лет хранения при температуре 1−8 °С СортПродолжительность хранения, летРастенияКореньЧисло, шт.Длина побега, смЧисло, шт.Длина, смБаклановский422,512,30,510,5Фиолетовый ранний310,3––Сыпун черный411,010,8Цимладар41–4   Дальнейшее культивирование этих восстановленных растений в стандартных условиях культуральной комнаты при освещенности 2,0–3,0 тыс. люксов, фотопериоде 16 ч, температуре 25–27 ± 2 °С, влажности воздуха 70–75 % на твердой питательной среде Мурасиге-Скуга с добавлением регулятора роста «Мелафен» в концентрации 10–7 способствовало дальнейшей регенерации и улучшению ростовых процессов как корней, так и побегов, что показано в таблице 7. Происходило полное восстановление растений. Таблица 7Показатели ростовых процессов восстановленных растений при культивировании в течение 3 месяцев СортКорниВысота, смЧисло листьеввсего, шт.Коэффициент полярностиЧисло, шт.Длина, смРизогенная зона, смФиолетовый ранний2,10,71,71,52,00,7Баклановский3,02,47,24,54,21,6Сыпун черный4,61,67,34,65,11,5Цимладар4,00,93,61,72,02,1  На основании полученных данных впервые доказана возможность беспересадочного хранения пробирочных растений винограда при температуре 1−8 °С   в течение 3−4 лет. Заключение 1. В процессе продолжительного беспересадочного культивирования растений на питательной среде с повышенными концентрациями сахарозы появлялось осенняя окраска листьев и происходило вызревание побегов. Наибольшее число растений с вызреванием побегов обнаружено при концентрации сахарозы 50−70 г/л.2. Степень вызревания in vitro зависит от сортовых особенностей растений: высокая у сортов Сыпун черный, Виерул, Цимлянский черный (клон 2-3); средняя у сортов Каберне Совиньон, Кумшацкий, Рупестрис дю Ло, Цимладар; слабая у растений сортов Красностоп Золотовский, Баклановский, Сибирьковый.3. Для дальнейшего замедления ростовых процессов и сохранения уже вызревших растений необходимо осуществлять культивирование их при пониженной положительной температуре.4. Выявлено, что в результате хранения при температуре 1−8 °С в течение 3–4 лет растения имели длину вызревшей части побегов 49,8−70,3 %. Лучшее вызревание по сравнению с аборигенными отмечено у межвидовых сортов винограда и подвоев.5. Учет, проведенный через месяц культивирования, показал, что при высадке одревесневших микрочеренков с живыми тканями на твердую питательную среду Мурасиге-Скуга произошли единичная регенерация побегов и восстановление растений.6. Культивирование этих восстановленных растений в стандартных условиях культуральной комнаты на твердой питательной среде Мурасиге-Скуга с добавлением регулятора роста «Мелафен» в концентрации 10–7 способствовало дальнейшей регенерации и улучшению ростовых процессов как корней, так и побегов. Произошло полное восстановление растений.7. На основании полученных данных впервые доказана возможность беспересадочного хранения пробирочных растений винограда в течение 3−4 лет при сочетании двух факторов: повышенной концентрации сахарозы в составе питательной среды и пониженной положительной температуры 1−8 °С.