Введение. В современном динамическом развитии общества вопрос получения и внедрения новых видов обогащенных пищевых продуктов требует безотлагательного решения представителей научных, технических и технологических представителей сообществ. Основой решения данного вопроса являются научные исследования и полученные на их основе разработки, в результате которых будут получены новые знания в виде новых экспериментальных данных, а также разработаны новые подходы, методы и способы для формирования базы новых технологий [1–3]. Новая структура питания человека подразумевает ряд обстоятельств, с изменением которых необходимо корректировать методологию обогащения пищевых продуктов. Эти условия связаны с пищевой ценностью продуктов, их усвояемостью, изменениями экологии и климата, питанием в регионах, а также пополнением рынка новыми продуктами с различными функциональными особенностями [4–6]. Программы профилактики микронутриентной недостаточности были сформулированы в начале 80-х гг. ХХ в. В основе Государственной политики здорового питания проводится мониторинг данных эпидемиологического состояния, пищевых предпочтений населения, а также профилактических мероприятий [7]. Целенаправленное обогащение культуральной среды микроэлементами позволит повысить уровень органической формы металла в дрожжевой биомассе за счет аккумулирования неорганических солей в процессе выращивания. Уровень обогащения хлеба при использовании фортифицированных микроэлементами дрожжей позволит обеспечить не менее 15 % от суточной потребности в эссенциальных микроэлементах. При использовании в рецептуре обогащенных дрожжей их количество значительно меньше, чем при использовании в рецептуре приготовления обогащенного хлеба [8–10]. Современные микробиологические методы, включая многоступенчатую селекцию и скрининг микроорганизмов, – один из важнейших путей получения перспективных штаммов для использования в технологиях получения пищевых ингредиентов. Цель исследования – использование современных микробиологических подходов для получения нового штамма хлебопекарных дрожжей. Объекты и методы. В качестве объектов для исследования были выбраны штаммы хлебопекарных дрожжей лаборатории биотехнологии пекарных дрожжей Института пищевой биотехнологии. Селекцию и скрининг штамма дрожжей осуществляли путем клонального рассева клеток исходного штамма на агаризованные среды с глюкозо-аспарагиновой средой (8 % СВ) и солодовым суслом (12 и 18 % СВ). Содержание сырого протеина в дрожжевой биомассе определяли методом Кьельдаля на автоматической установке BEGER (Словения) [11]. Накопление биомассы определяли весовым методом после культивирования, разделяя центрифугированием твердую и жидкую фракции [12]. Мальтазную, зимазную и протеолитическую активности определяли согласно известным методикам [13]. Содержание эргостерина – спектрофотометрическим методом, основанном на экстракции этанолом и серной кис­лотой с тритерпеновыми соединениями при длине волны λ = 328 нм [14]. Биомассу (твердая фракция) отделяли от фильтрата центрифугированием на лабораторной центрифуге ОПМ-16 в течение 15 мин при скорости вращения ротора 6 000 об/мин. Для статистической обработки экспериментальных данных, полученных не менее, чем в 3 повторностях, использовали метод однофакторного дисперсионного анализа с апостериорным критерием Тьюки при р < 0,05 и программы Statistica 6.0. Результаты и их обсуждение. На первом этапе проводили сравнительные исследования количественных и качественных характеристик хлебопекарных дрожжей S. cerevisiae с целью установления перспективного для обогащения штамма. В результате сравнительной характеристики штаммов Saccharomyces cerevisiae был выбран Y-581, характеризующийся способностью к более высокому уровню синтеза белка, мальтазной, зимазной активностей, а также показателей эргостерина и осмочувствительности (табл. 1).     Таблица 1 Сравнительная оценка штаммов хлебопекарных дрожжей по биохимическим показателям   Номер штамма Saccharomyces сerevisiae Сырой протеин, % на а.с.в. Осмочувствительность, мин Мальтазная активность, мин Зимазная активность, мин Эргостерин, % на а.с.в. Накопление биомассы, % Y-576 41,0± 2,0 18±0,8 76±3,8 69±3,4 7,6±0,3 5,8±0,3 Y-501 42,4±2,1 13±0,5 80±3,9 48±2,8 9,8±0,5 5,5±0,2 Y-53 42,5±2,2 16±0,6 85±4,2 52±2,5 5,5±0,2 5,2±0,2 Y-1218 42,0±2,0 19±0,8 68±3,0 63±3,3 5,2±0,2 4,7±0,2 Y-581 42,6±2,2 12±0,4 89±4,8 45±2,2 10,8±0,6 5,9±0,3 Y-3439 41,8±2,2 20±0,5 65±3,2 58±2,8 6,2±0,3 4,3±0,2 Y-59 40,4±2,0 20±0,5 64±3,0 70±3,3 4,7±0,2 4,0±0,1 Y-722 41,2±2,1 22±0,5 72±3,6 72±3,5 4,3±0,2 4,8±0,2 Здесь и далее: данные представлены в виде средних ± стандартное отклонение.     На следующем этапе работы была проведена многоступенчатая селекция и скрининг отобранного штамма S. cerevisiae Y-581 для выделения более активного варианта, перспективного к обогащению железом и медью. Основными биохимическими признаками для фортификации дрожжей являются содержание белка и осмочувствительность (проницаемость клеточной стенки дрожжей). Первым этапом селекционных работ являлся отбор активных вариантов по содержанию белка и осмочувствительности. При клональном рассеве клеток стабильного исходного дрожжевого штамма Y-581 на агаризованную среду наблюдали рост однотипных по цвету и морфологии колоний, различающихся размером. В результате рассева данного штамма на глюкозо-аспарагиновую среду с концентрацией СВ 8,0 % были выделены 12 активных колоний на 144 ч выращивания при температуре 30 °С, показатели которых представлены в таблице 2.   Таблица 2 Сравнительная характеристика активных вариантов Saccharomyces cerevisiae Y-581   Вариант Сырой протеин, % на а.с.в. Осмочувствительность, мин 581-ГА-7 42,0±2,1 14,0±0,7 581-ГА-12 45,2±2,2 18,5±0,9 581-ГА-14 38,2±1,9 17,5±0,8 581-ГА -18 41,5±2,0 20,5±1,0 581-ГА-21 46,2±2,3 10,5±0,5 581-ГА-29 35,0±1,7 17,5±0,8 581-ГА-35 37,8±1,8 13,5±0,6 581-ГА-37 36,9±1,8 18,0±0,9 581-ГА-41 41,2±2,0 15,5±0,7 581-ГА-45 45,3±2,2 13,5±0,6 581-ГА-52 42,2±2,1 14,5±0,7 581-ГА-61 39,5±1,8 11,9±0,5 Исх. 581 42,3±2,1 12,5±0,6     В результате проведенных селекционных исследований отобрана наиболее активная популяция Saccharomyces cerevisiae 581-ГА-21, обладающая способностью к повышенному синтезу белка (46,2 %) и более низким уровнем осмочувствительности (10,5 мин) по сравнению с контрольным вариантом (табл. 2). На втором этапе селекции было исследовано влияние различных концентраций агаризованных сред, используемых для рассева выделенного варианта S. cerevisiae 581-ГА-21, на изменения его биосинтетических свойств. Для отбора колоний использовали агаризованные среды с концентрацией солодового сусла с 12 и 18 % СВ. Отобранные клоны тестировали по уровню синтеза белка и осмочувствительности (табл. 3).   Таблица 3 Сравнительная характеристика активных вариантов дрожжей Saccharomyces cerevisiae 581-ГА-21   Вариант 12 % СВ 18 % СВ Вариант Сырой протеин, % на а.с.в. Осмочувствительность, мин Сырой протеин, % на а.с.в. Осмочувствительность, мин 581-ГА-3с 43,2±2,1 15,5±0,7 42,0±2,1 14,0±0,7 581-ГА-5с 581-ГА-11с 47,0±2,3 13,5±0,6 46,2±2,3 11,5±0,5 581-ГА-13с 581-ГА-14с 39,2±1,9 14,5±0,7 39,9±1,9 11,9±0,5 581-ГА-17с 581-ГА-17с 41,7±2,0 19,5±0,9 42,5±2,1 10,8±0,5 581-ГА-19с 581-ГА-23с 52,1±2,6 7,0±0,3 53,6±2,6 5,5±0,2 581-ГА-21с 581-ГА-29с 42,3±2,1 17,5±0,8 35,0±1,8 14,5±0,7 581-ГА-27с 581-ГА-33с 39,0±1,9 18,5±0,8 37,8±1,9 13,5±0,6 581-ГА-30с 581-ГА-40с 39,9±1,9 12,5±0,6 36,9±1,9 12,3±0,6 581-ГА-32с 581-ГА-44с 41,8±2,0 14,5±0,7 44,2±2,2 15,1±0,7 581-ГА-42с 581-ГА-48с 42,6±2,1 17,1±0,8 45,3±2,5 9,5±0,4 581-ГА-47с 581-ГА-51с 46,5 ±2,3 12,5±0,6 43,2±2,3 6,9±0,3 581-ГА-50с 581-ГА-57с 43,2±2,1 19,0±0,9 39,5±1,9 0,9±0,4 581-ГА-56с Исх. 581 44,2±2,2 10,7±0,5 44,8±2,2 10,0±0,5 Исх. 581     При культивировании дрожжей в глубинных условиях на стандартной питательной среде при температуре 30 °С в течение 48 ч установлено, что более высокой биосинтетической способнос­тью по отношению к белку обладали 3 популяции, выделенные при рассеве на средах с концентрацией РСВ 12 %, и 2 клона Y – 18 %, из которых клон Saccharomyces cerevisiae 581-ГА-21с (выделенный со среды с 18 % СВ) проявил наилучшие показатели по содержанию белка и осмочувствительности (см. табл. 3). В этом варианте содержание белка составило 53,6 % и осмочувствительность – 5,5 мин, что превысило показатели исходного штамма по белку на 19,6 %, а осмочувствительность снизилась в 1,8 раза. Результаты сравнительных исследований биосинтетической способности выделенного и исходного штамма показали, что уровень синтеза эргостерина увеличился несущественно, но по содержанию белка клон S. cerevisiae Y-581-ГА-21с превосходил показатели исходного штамма. При этом осмочувствительность снизилась на 45 %; отмечено также некоторое повышение его зимазной (на 38,9 %) и протеолитической (на 42,3 %) активностей по сравнению с показателями, полученными при тестировании исходного штамма дрожжей (рис. 1, а, б). Таким образом, в результате многоступенчатой селекции исходного штамма S. cerevisiae Y-581 была выделена популяция Saccharomyces cerevisiae 581-ГА-21с, несколько отличающаяся по морфологическим признакам (рис. 2) и с более высокой биосинтетической способнос­тью не только по отношению к эргостерину и белку, но и к синтезу ферментов, особенно протеолитических. Кроме того, выделенный штамм обладал более высокой проницаемостью клеточной мембраны, о чем свидетельствовали показатели его осмочувствительности.     а   б   Рис. 1. Биохимические показатели исходного и селекционированного штамма S. cerevisiae Y-581с                                                                 S. cerevisiae Y-581                             S. cerevisiae Y-581-ГА-21с (Y-581с)   Рис. 2. Штаммы дрожжей S. cerevisiae Y-581 и S. cerevisiae Y-581-ГА-21с     Заключение. Селекционированный штамм S. cerevisiae Y-581с был выбран в качестве перспективного объекта по основным признакам, необходимым для фортификации микроэлементами (высокое содержание белка и эргостерина, низкая осмочувствительность и повышенная протеолитическая активность). На основании современных микробиологичес­ких подходов получен новый штамм хлебопекарных дрожжей S. cerevisiae Y-581-с, который будет использован в дальнейших исследованиях по созданию ингредиентов различного состава.