Введение. Нитраты – это соли азотной кислоты, имеющие в составе молекулы ион NO3-. Нитраты широко распространены в растительных объектах, являясь их основным питательным элементом за счет легкоусвояемого водорастворимого азота. Внесение в почву минеральных удобрений с целью ускорения роста и увеличения урожайности культур, вид овощей и условия вегетации в значительной степени влияют на содержание нитратов в них [1, 2]. Нитраты оказывают токсическое воздействие на организм человека, вызывая метгемоглобинемию, а под воздействием кислой среды и микрофлоры желудка восстанавливаются до нитритов NO2-, в значительной степени более токсичных и способных к образованию канцерогенных нитрозаминов [3, 4]. Страны Европейского союза приняли регламент комиссии ЕС, устанавливающий максимальные уровни нитратов в некоторых овощах и продуктах их переработки [5].Для определения нитратов в различныхобъектах окружающей среды и пищевых продуктах на сегодняшний день широкое распространение в практике нашло несколько основных методов. Так, в питьевой воде определение проводят спектрофотометрически с 2,6-диме­тилфенолом [6], сульфосалициловой кислотой [7], восстановлением до комплекса фосфомолибденового синего [8], салицилатом натрия [9, 10], хромотроповой кислотой [11], 2,4-кси­ленолом [12, 13], 2-аминобензойной кислотой, кадмиево-медной колонкой [14]. Для пищевых продуктов наиболее широко применяется спектрофотометрический метод определения нитратов, с предварительным восстановлением их до нитритов на кадмиевой колонке, образующих затем ярко-окрашенное диазосоединение с максимумом поглощения в видимой области 535–540 нм, стандартизированный в международных стандартах для молока [15], мяса [16], фруктов, овощей и продуктов их переработки [17]. Однако данный подход требует значительных затрат времени при рутинных определениях, использования токсичного металлического кадмия и контроля эффективности его восстанавливающей способности. Потенциометрическое определение с помощью ионоселективного электрода – достаточно простой способ, который позволяет избежать использование опасных реагентов, но, к сожалению, не дает сопоставимых результатов с другими методами, ввиду значительной систематической погрешности, связанной с влиянием сложного ионного состава образца, особенно в области низкого содержания нитратов, и может использоваться лишь для ориентировочной оценки уровня нитратов в овощах [18–20].В последнее время для определения нитратов в овощах все большее распространение получает метод жидкостной хроматографии, отличительной особенностью которого является быстрота и простота подготовки образца для определения, высокая чувствительность и селективность за счет определения в ультрафиолетовой области спектра, позволяющая определить даже следовые количества нитратов на уровне 1 мг/кг [21–24], однако данный метод требует использования сложного дорогостоящего оборудования и соответствующей квалификации персонала, что не всегда оправдано при проведении рутинных испытаний, особенно при контроле входящего сырья на перерабатывающих производствах.Представлен подход, основанный на известной реакции нитрования салицилата натрия в присутствии серной кислоты, с образованием соли нитросалициловой кислоты, имеющей в щелочной среде желтую окраску, интенсивность которой определяют фотометрически [10]. Спектрофотометры широко распространены в различных агрохимических лабораториях, благодаря их относительно невысокой стоимости, простоте измерения и высокой чувствительности.В данном исследовнаии поставлены задачи по изучению процедуры экстракции и очистки проб с целью удаления из них углеводов и красящих веществ природного происхождения; стабильности окраски полученных растворов и сравнению полученных результатов с контрольным методом. В качестве смешанного салицилатного реагента использовался раствор, состоящий из 1 % салицилата натрия с добавлением сульфаминовой кислоты с целью разложения мешающих определению нитрит-ионов NO2-.Цель исследования – валидация спектрофотометрического метода определения нитрат-ионов в овощах с применением салицилата натрия в качестве нитрующего реагента с применением метода твердофазной экстракции на ионообменном картридже SAX. Задачи исследования: подбор условий твердофазной экстракции; оценка линейности и стабильности градуировочной зависимости; сравнение полученных результатов с контрольным методом ВЭЖХ.Объекты и методы исследования1. Объекты исследованийВ качестве проб использовали свежие огурцы, редьку, болгарский перец, картофель, репчатый лук, кабачки, приобретенные в торговой сети (Россия, зимний период, январь 2021 г.), очищенные от несъедобной части и измельченные на гомогенизаторе GM 200 (Retsch, Германия) до гомогенного однородного состояния. Пробы хранили при температуре 2–4 °C в холодильнике. Реактивы и стандарты Салицилат натрия (Sigma 71945), сульфаминовая кислота (Sigma 24277-2), серная кислота (112080 Supelco), гидроксид натрия (106469 Supelco), октиламин (Sigma 05802), ортофосфорная кислота 85 % (EMSURE 1.00573), метанол (LiChrosolv 1.06018) isocratic grade, сульфат натрия (EMSURE 1.06649). Исходный стандартный раствор с массовой долей нитратов 10 % готовили растворением 10,0 г нитрата калия (105063 Supelco) в 100 см3 воды. Смешанный окрашивающий реактив готовили, смешивая 1,0 г салицилата натрия и 0,1 г сульфаминовой кислоты в 100 см3 воды.2. Экстракция нитратов из пробыВзвешивали 5 г измельченной пробы овощей на весах LA 620 (Sartorius, Германия) с точностью до 0,01 г и количественно переносили с помощью 50 см3 деионизированной водой температурой 60 °С в мерную колбу вместимостью 100 см3. Полученный раствор фильтровали через складчатый бумажный фильтр MN 418 (Macherey-Nagel, Германия), согласно процедуре, описанной в [25].Фильтрат объемом от 1 до 5 см3 очищали на картридже SAX (Agilent, США), затем элюировали 5 см3 раствора сульфата натрия Na2SO4 0,5 моль/дм3. Полученный элюат использовали для дальнейших определений. Данный объем был выбран в связи с тем, что при меньшем количестве развитие окраски было недостаточно интенсивно, а при большем объеме увеличивалось время выпаривания.3. Спектрофотометрическое определениеК фильтрату после очистки на картридже прибавляли 1 см3 смешанного окрашивающего реактива и выпаривали досуха на кипящей водяной бане. Сухой остаток подвергали реакции нитрования в присутствии серной кислоты [9]. Одновременно готовили контрольный раствор с теми же реактивами.Построение градуировочной зависимости проводили, используя растворы сравнения, приготовленные из стандартного раствора нитрата калия, с массовой долей 10 %, с содержанием нитратов, соответствующих по массе 0,05; 0,1; 0,25; 0,5; и 1,0 мг [9]. Через 15 мин измеряли оптическую плотность полученных растворов по отношению к контрольному раствору на спектрофотометре Cary UV-100 (Agilent, Австралия) при длине волны 410 нм в кюветах из прозрачного пластика с толщиной 10 мм (Brand, Германия). С целью оценки стабильности окраски градуировочных растворов проводили повторные измерения оптической плотности в течение трех дней (через каждые сутки). Обработку полученных данных и построение графика зависимости оптической плотности от концентрации проводили с помощью программного обеспечения Cary WinUV 3.0 (Agilent, Австралия), методом наименьших квадратов.4. ВЭЖХ определениеОчищенный на картридже фильтрат также использовали для определения стандартным методом [26]. Определения проводили на жидкостном хроматографе Shimadzu LC-20 (Shimadzu, США), состоящем из насоса LC-20AD, автосамплера SIL-20A, спектрофотометрического детектора SPD-20A, обработку хроматограмм и построение градуировочной зависимости выполняли с помощью программного обеспечения Shimadzu LC Solution 2.0. Для разделения нитратов использовали колонку Hypersil GOLD, длина 150 мм, диаметр 3 мм (Thermo Fisher, США), с неподвижной фазой С18 (включая предколонку). Объем инжекции – 10 мм3. В качестве подвижной фазы использовали смесь 0,01 М раствора ортофосфата октиламина рН (7,0±0,5) и метанола в соотношении 1:1, скорость потока 1,5 см3/мин, температура 35 °С, в изократическом режиме, в течение 15 мин, детектирование при длине волны 210 нм. Время удерживания нитрата составило 6,78 мин. Перед определением фильтрат пропускали через мембранный фильтр Minisart 0,45 мкм, Nylon (Sartorius, Германия) в виалу. Определения проводились в тот же день, что и на спектрофотометре. Для построения градуировочной зависимости использовали стандартные растворы нитрата калия с содержанием нитратов 1; 10; 25; 50 мг/дм3, по 2 параллельных измерения на каждый уровень. С целью оценки воспроизводимости результатов во всем линейном диапазоне и степени нахождения нитратов для обоих методов использовали добавки стандартного раствора нитрата калия к фильтрату. Результаты измерений представлены в таблицах 1, 2. Таблица 1Результаты измерений содержания нитратов в свежих овощах из торговой сети двумя методами ОбразецСодержание, мг/кг (среднее значение повторных определений n = 6)Относительное стандартноеотклонение, СКО, %Кабачки829a ± 1900,40847b ± 1014,93Лук249a ± 573,17345b ± 4110,56Картофель513a ± 1185,71520b ± 627,22Редька950a ± 2182,391082b ± 1293,32Огурцы32a ± 78,9842b ± 59,75Болгарский перец139a ± 329,74147b ± 172,47a Метод с применением салицилата натрия.b Стандартный метод ВЭЖХ. Таблица 2Результаты измерений содержания нитратов в овощахс добавкой стандартного раствора нитрата калия спектрофотометрическим методом ОбразецНачальное содержание, мг/кгПолученное содержаниеa, мг/кгНайдено, %Кабачки829 ± 1901659 ± 381104Лук249 ± 57600 ± 138116Картофель513 ± 1181029 ± 23699Редька950 ± 2181974 ± 454103Огурцы32 ± 778 ± 17118Болгарский перец139 ± 32336 ± 77111Среднее значение109a Внесено 100 % от исходного содержания, среднее значение повторных определений n = 6.  Результаты исследования и их обсуждение. Результаты по оценке стабильности градуировочных растворов для спектрофотометрического определения представлены в таблице 3.  Таблица 3Результаты измерений оптической плотности растворов при λ = 410 нм Масса нитрата,мгОптическая плотность ЧасыСреднее значениеСтандартное отклонение ±SDРазмахΔD 0244872 n = 4 0,0500,08280,09670,08100,08420,08620,00710,0157 0,1000,18220,19600,17680,17500,18250,00950,0210 0,2500,49690,54150,49680,50030,50890,02180,0447 0,5000,98190,98300,99120,97810,98360,00550,0131 1,0001,72521,73431,72821,72981,72940,00380,0091  Как видно из полученных значений, на вторые и последующие сутки нет значительной разницы между оптическими плотностями растворов, что говорит о их высокой стабильности.Результаты построения градуировочной зависимости с использованием соответствующих растворов представлены на рисунке 1. Также были рассчитаны основные параметры метода (табл. 4).   Рис. 1. Градуировочная кривая для спектрофотометрического метода  Таблица 4Основные характеристики метода определения нитратов при λ = 410 нм ПоказательЗначениеЛинейный диапазон определяемых масс, мг0,05–1,0Уравнение градуировочного графикаy = 1,7323·x+0,0398Коэффициент корреляции, n = 3r2 = 0,9968Предел обнаружения, мг (LOD = 3,3·S/a)0,018Предел определения, мг (LOQ = 10·S/a)0,055  Для метода ВЭЖХ проводили построение графика зависимости площади пика от уровня с применением метода наименьших квадратов, основные параметры метода были рассчитаны на его основе (рис. 2, табл. 5).С целью сравнения двух групп данных, полученных при измерении 36 образцов, осуществляли их обработку с применением модели линейной регрессии y = ax + b при уровне доверительной вероятности P = 0,95 (рис. 3). Проверку значимости уравнения линейной регрессии проводили с помощью программного пакета MS Excel, используя дисперсионный анализ (ANOVA).   Рис. 2. Градуировочная кривая для метода ВЭЖХ Таблица 5Основные характеристики метода определения нитратов при λ = 210 нм ПоказательЗначениеЛинейный диапазон определяемых концентраций, мг/л1,0–50,0Уравнение градуировочного графикаy = 87076·x-22813Коэффициент корреляции, n = 3r2 = 0,9999Предел обнаружения, мг (LOD = 3,3·S/a)0,114Предел определения, мг (LOQ = 10·S/a)0,345  Рис. 3. Графическая зависимость результатов измерений двумя методами Регрессионный анализ методом наименьших квадратов показал, что обе группы результатов хорошо согласуются между собой и описываются уравнением линейной зависимости y = 1,0673x + 14,822 с высоким коэффициентом корреляции R2 = 0,9855. Учитывая, что коэффициент уравнения b > 0, это означает, что связь между двумя методами прямая. Дополнительно проводили оценку значимости коэффициентов a и b с помощью t-критерия Стьюдента. Полученное значение tb = 67,75 больше табличного 2,29, что говорит о значимости данного коэффициента; значение ta = 1,66 меньше табличного 2,29, статистическая значимость этого коэффициента регрессии не подтверждается.Заключение. Большинство используемых в настоящее время методов определения нитратов являются медленными и сложными в исполнении либо требуют дорогостоящего оборудования. Был предложен метод, который может быть использован в лабораториях с ограниченными ресурсами при сохранении необходимой чувствительности и точности. На основе описанной в литературе процедуры, с применением салицилата натрия в качестве нитрующего реагента были сопоставлены полученные результаты со стандартным методом.