Введение. Гречиха посевная Fagopyrum esculentum Moench – культура многоцелевого использования. Из нее получают продукты питания, лекарства, зеленое удобрение, это прекрасный медонос и богатый источник рутина, катехинов и других флавоноидов [1]. Она обладает высокой пластичностью и большим потенциалом в селекционных программах [2]. Применение биотехнологических методов в выведении новых сортов считается перспективным направлением сельскохозяйственной науки. Селекция F. esculentum с использованием тяжелых металлов (ТМ) в качестве селективных фонов in vitro может быть новым инструментом создания растений с улучшенными показателями и высоким потенциалом устойчивости к средовым абиотическим стрессорам [3].Влияние селективных сред, содержащих повышенные дозы солей цинка (46–606 мг/л) и меди (6–230 мг/л), на рост и развитие микропобегов гречихи посевной исследовано в более ранних наших работах [4]. Однако существует мнение, что повышение жесткости селективных систем является весьма эффективным методом селекции [5], поэтому изучение токсического воздействия более высоких доз тяжелых металлов на культуру гречихи посевной in vitro может быть перспективным направлением решения селекционных задач.Цель исследования – изучить влияние токсического действия высоких доз цинка (808–1313 мг/л) на жизнеспособность пробирочных растений-регенерантов Fagopyrum esculentum Moench и получить in vitro исходный материал гречихи с использованием селективных сред с Zn2+.Объекты и методы. Объектами исследования являлись одноузловые черенки (длина 1,0–1,5 см) регенерантов гречихи посевной сорта Изумруд селекции ФНЦ агробиотехнологий Дальнего Востока им. А.К. Чайки, которые получали в результате деления стебля пробирочных микрорастений (2–3 нижних междоузлия), ранее прошедших отбор в селективных условиях с CuSO4 × 5H2O в концентрации 161 и 184 мг/л [4]. Изолированные in vitro объекты культивировались в пробирках с ватно-марлевыми пробками при освещенности 4 тыс. лк, температуре 22–25 °С, фотопериоде 16 ч в условиях культуральной комнаты. Приготовление и стерилизация бокса, посуды, инструментов проводились по общепринятым методикам.Для создания селективных условий использовали соль цинка (ZnSO4 х 7H2O). В основную питательную среду Мурасиге-Скуга [6] (далее МС), содержащую 20 г/л сахарозы и 6 г/л агара, вносили соли цинка в следующих количествах по вариантам опыта: 808, 909, 1010, 1111, 1212 и 1313 мг/л. Контрольным вариантом являлась среда МС с сахарозой и агаром и со стандартным содержанием сульфата цинка 8,6 мг/л. Число пробирок по каждому варианту – 20. Повторение – 5.Морфологические показатели определяли на 21-е сут культивирования растений на контроле и селективных средах с цинком, а также по окончании последующих пассажей (каждый пассаж длительностью 33 сут) на питательных средах МС. Измеряли высоту каждого пробирочного растения и длину его листовых пластинок, которые выражали соответственно в см и мм, считали число междоузлий и число листьев (шт.), отмечали наличие (+) или отсутствие (-) корней. Окраску листьев определяли визуально по преобладающему цвету всех листовых пластинок растения.Для ввода данных, обработки исходных данных и статистического анализа использовали пакет программ Microsoft Excel 2010. Программное обеспечение Statistica 6 [7] использовали для выполнения однофакторного дисперсионного анализа. Тест множественного рангового критерия Дункана (p < 0,05) применяли для измерения значимости различий. Результаты выражаются в виде средних значений ± стандартное отклонение.Результаты и их обсуждение. Исследование устойчивости пробирочных растений-регенерантов линий гречихи сорта Изумруд, полученных в результате отбора после обработки CuSO4 × 5H2O, к высоким дозам цинка и их морфологический анализ проводили на 21-й день культивирования микроклонов на селективных средах (табл. 1).Все испытуемые линии существенно отставали в развитии по сравнению с контролем, особенно по показателю высота растения, которая в среднем составила 0,38–2,01 см (в 3,5–14,1 раза меньше, чем у растений контрольной группы), и приобретали желто-зеленую окраску. Листовые пластинки стали более мелкими, длиной 3,78–8,70 мм, а их количество снизилось на 21,6–66,6 % по сравнению с контролем. Количество междоузлий уменьшилось в 1,9–3,8 раз. Максимальное негативное воздействие на микроклоны оказали селективные условия с концентрацией от 909 до 1313 мг/л ZnSO4 × 7H2O. Сильная токсическая нагрузка повлияла на корнеобразование (важнейший показатель, отражающий состояние растений в условиях стресса) – ризогенез отсутствовал на всех вариантах. По мнению многих исследователей, токсичность тяжелых металлов, приводящая к снижению роста и развития растений, обусловлена в первую очередь окислительным стрессом, индуцируемым ТМ; в итоге нарушается работа фотосинтетического аппарата и всего растительного организма в целом [8, 9]. Таблица 1Влияние селективных сред с ZnSO4 × 7H2O на развитие микрорастений гречихи,толерантных к повышенному содержанию меди, на 21-е сут культивирования Вариант содержания соли цинкаВысота растения, смЧисло междоузлий, шт.Число листьев, шт.Длина листовой пластинки, ммНаличие корней, +/-Окраскалистьев1234567Изумруд in vitro после CuSO4 х 5H2O 161 мг/лКонтроль7,03±2,60 c3,78±0,44 c5,11±0,78 c11,33±2,45 c+Зеленые808 мг/л2,01±1,32 b2,00±0,67 b3,80±1,23 b7,90±1,66 b–Зелено-желтые909 мг/л1,44±0,56 b1,38±0,52 a3,50±1,31 а8,13±1,36 b–Желто-зеленые1010 мг/л0,69±0,28 a1,00±0,00 a2,80±1,23 a6,50±2,17 b–Желто-зеленые1111 мг/л0,43±0,23 a1,00±0,00 a2,86±0,69 a6,43±1,99 b–Желто-зеленые1212 мг/л0,56  ±0,40 a1,00±0,00 a2,60±0,70 a4,50±2,99 a–Желто-зеленые1313 мг/л0,51±0,37 a1,00±0,00 a2,89±0,93 a3,78±2,54 a–Желто-зеленые Окончание табл. 11234567Изумруд in vitro после CuSO4 х 5H2O 184 мг/лКонтроль6,64±2,75 b3,8±0,42 c5,10±0,74 b11,1±2,42 d+Зеленые808 мг/л1,18±0,81 а1,60±0,70 b3,00±0,67 а8,70±2,31 c–Зеленые909 мг/л0,90±0,62 а1,56±0,53 b2,33±0,50 a7,56±2,40 bс–Зелено-желтые1010 мг/л0,82±0,29 a1,11±0,33 a2,67±0,71 a7,33±1,80 аbс–Зелено-желтые1111 мг/л0,47±0,39 a1,11±0,32 a2,60±0,52 a5,70±1,16 ab–Желто-зеленые1212 мг/л0,56±0,27 a1,11±0,33 a2,44±0,73 a6,89±2,09 аbс–Желто-зеленые1313 мг/л0,38±0,28 a1,11±0,32 a2,50±0,71 a5,30±2,54 a–Желто-зеленыеЗдесь и далее: разные строчные буквы (а, b, с, d) в одном и том же столбце по каждому опыту указывают на значимые различия между вариантами при P < 0,05.  При дальнейшем культивировании микроклонов на питательной среде МС со стандартным содержанием ZnSO4 × 7H2O (8,6 мг/л) (I пассаж) в течение 33 сут выявлено, что токсическое влияние тяжелого металла сохранилось, однако растения выглядели менее угнетенными, что выразилось в увеличении показателей морфологического развития (табл. 2). Некоторое превышение над контролем числа междоузлий и листьев по исследуемым вариантам связано с тем, что у многих испытуемых растений на данном этапе опыта появились морфологические изменения: нижние листья были собраны в розетку, при этом наблюдалось уменьшение листовых пластинок в размере, а стебли укорачивались.  Таблица 2Морфологические показатели регенерантов гречихи на питательных средах МС после меди и цинка Вариантсодержания соли цинкаВысотарастения, смЧисломеждоузлий,шт.Числолистьев, шт.ДлинаЛистовойпластинки,ммНаличие корней, +/-ОкраскалистьевИзумруд in vitro после CuSO4 × 5H2O 161 мг/лКонтроль17,1±2,4 c5,9±0,9 ab6,9±0,9 a10,6±1,2 c+Зеленые 808 мг/л14,2±4,1 bc6,9±2,1 b9,8±3,3 a10,0±1,8 c+Зеленые909 мг/л10,7±6,0 b7,4±1,5 b12,8±5,4 a7,6±1,9 b–Зелено-желтые1010 мг/л8,6±4,3 ab6,8±1,0 b13,0±5,4 a7,5±1,8 b–Зелено-желтые1111 мг/л10,1±3,9 b7,3±1,4 b11,5±3,9 a7,3±2,0 b–Зелено-желтые1212 мг/л7,3±5,6 ab6,5±2,5 ab12,6±5,6 a6,2±2,3 ab–Зелено-желтые1313 мг/л4,2±3,4 a4,9±2,8 a9,7±6,1 a4,8±1,9 a–Зелено-желтыеИзумруд in vitro после CuSO4 × 5H2O 184 мг/лКонтроль16,5±2,8 c5,8±1,0 b6,8±1,1 a12,8±0,8 d+Зеленые 808 мг/л16,3±3,4 c7,2±1,1 b10,1±2,4 abc11,0±1,2 cd+Зеленые 909 мг/л16,0±4,8 c7,9±1,2 b13,6±6,7 d9,2±1,8 bc+Зеленые1010 мг/л13,6±3,3 c7,8±0,6 b12,6±2,2 cd7,9±1,9 b–Зелено-желтые1111 мг/л7,7±4,2 b7,3±1,7 b11,5±3,6 bcd7,5±1,4 b–Зелено-желтые1212 мг/л8,9±5,6 b6,8±2,2 b9,3±3,7 ab8,5±2,9 b–Зелено-желтые1313 мг/л5,3±4,0 a5,0±3,1 a8,6±4,4 ab5,3±2,5 a–Зелено-желтые  Необходимо отметить, что у линий, полученных в результате последовательного отбора на средах с ТМ при использовании более высокой дозы CuSO4 × 5H2O (184 мг/л), ризогенез наблюдался на двух исследуемых вариантах последействия соли цинка (808–909 мг/л). В то же время у регенерантов, созданных на селективных средах со 161 мг/л соли меди, выявлена меньшая устойчивость к металлическому стрессу – корнеобразование наблюдалось только после культивирования на средах с 808 мг/л сульфата цинка. В итоге выживаемость генотипов, прошедших отбор в селективных системах с более высокой дозой соли меди (184 мг/л), на всех вариантах опыта с Zn2+ составила 100 %, а после 161 мг/л Cu2+ – не выжило 3 % микрорастений. Таким образом, подтверждается факт, что повышенная резистентность к одному стрессору может приводить к увеличению устойчивости к другому [10]. Проявления токсического стресса у полученных микрорастений полностью исчезли при последующем культивировании на питательных средах без токсиканта (II пассаж на МС) (рис.). Морфологические показатели регенерантов по вариантам слабо различались от контроля и между собой. Ризогенез у растений наблюдался на всех вариантах.     Рис. 1. Морфологические показатели регенерантов гречихи, полученных в результатепоследовательного отбора на селективных средах с медью и цинком (II пассаж на МС)  Ранее нами указывалось на толерантность клеточно-тканевых культур и микропобегов гречихи посевной к повышенным концентрациям сульфатов меди и цинка in vitro [4]. По мнению N.K. Chrungoo et al. [11], гречиха имеет широкий экологический диапазон пластичности, и, следовательно, она может хорошо расти практически при любых неблагоприятных условиях. Заключение. Гречиха посевная является культурой весьма пластичной и устойчивой к длительному воздействию высокотоксичных доз цинка, о чем свидетельствует большой процент выживших на селективных средах растений (97–100 %) и быстрое послестрессовое восстановление исследуемых микроклонов. Регенеранты, полученные в результате последовательного отбора на средах с использованием более высоких концентраций меди, показывают повышенную устойчивость к цинку. Отобраны толерантные к токсической нагрузке Cu2+ и Zn2+ генотипы F. еsculentum, которые в дальнейшем могут быть использованы для создания сортов регенерантного происхождения с индуцированными новыми хозяйственно полезными признаками, в т. ч. адаптированных к неблагоприятным условиям почвенного стресса, обусловленного токсичностью тяжелых металлов.