Введение. В ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» большое внимание уделяется изучению микроорганизмов, вызывающих инфекционные болезни у животных [1–11]. Современные данные подтверждают значительную роль сапрофитных и условно-патогенных микроорганизмов, а также их ассоциаций в развитии инфекционных заболеваний животных [12]. Микробиологическое исследование кожных покровов и глубжележащих тканей животных является важным диагностической инструментом  для идентификации этиологических агентов инфекций, вызывающих различные заболевания у животных и воздействия на них различных лекарственных препаратов [13]. Выбор конкретного препарата, его эффективность дозировка и длительность терапии определяются видом микроорганизмов, тяжестью вызываемых ими инфекций и общим состоянием здоровья животного.Механизм действия β-лактамных антибиотиков заключается в подавлении активности ферментов, необходимых для построения клеточной стенки микроорганизмов (рис. 1).    Рис. 1. Схема подавления активности металло-β-лактамаз ингибиторамиMethod for inhibiting the activity of metallo-β-lactamases with inhibitors   Вместе с тем микроорганизмы обладают способностью адаптироваться к применяемым антимикробным средствам, развивая устойчивость (резистентность) к ним, поэтому представляло интерес изучить механизм действия β-лактамных антибиотиков и разработать методы разрушения механизма формирования резистентности у микроорганизмов к β-лактамным антибиотикам, связанные с инактивацией ферментов, участвующих в синтезе клеточной стенки бактерий.В связи с этим повышение эффективности антибиотиков на фоне растущей антибиотикорезистентности остается одной из ключевых задач современной биотехнологии.Цель исследования – оценить влияние ингибиторов металло-β-лактамаз (МБЛМ) на сохранение антимикробной активности антибиотиков на микроорганизмы.Задачи: подбор, синтез и оценка комплексообразующих веществ, способных формировать устойчивые комплексы с цинком — металлом, входящим в активный центр МБЛМ и их совместимость с антибиотиками (рис. 2); определение оптимального соотношения антибиотика и ингибитора металло-β-лактамаз (ИМБЛМ); оценка антимикробной активности комбинаций антибиотика с ингибитором металло-β-лактамаз (ИМБЛМ) на смешанной культуре микроорганизмов бактерий – возбудителях болезней дистального отдела конечностей (Staphylococcus spp.) и на тест-культуре гриба (Candida tropicalis),  [L-Zn]2 – БЛМ Рис. 2. Схематическое представление комплексов ИМБЛМ с двумя ионами цинкаSchematic representation of IMBLM complexes with two zinc ions  Объекты и методы. Сбор и анализ данных проведены согласно Р 4.2.3676-20. «Методы лабораторных исследований и испытаний дезинфекционных средств для оценки их эффективности и безопасности (утв. Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 18.12.2020) в 2025 г. в лаборатории ветеринарной санитарии отделения биотехнологии ФГБНУ «Федерального центра токсикологической, радиационной и биологической безопасности», а также в лаборатории микотоксинов, отделения токсикологии. Тест-культуры были получены в коллекции микроорганизмов ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». Выбор компонентов ингибиторов металло-β-лактамаз (ИМБЛМ) был обоснован комплексообразующими свойствами ионов цинка, входящих в активный центр β-лактамаз.Результаты и их обсуждение. Ранее нами совместно с сотрудниками Института органической и физической химии им. А.Е. Арбузова ФИЦ КазНЦ РАН из опытной комплексообразующей реакционной смеси с различными антибиотиками был выделен и охарактеризован устойчивый тартрат-цинковый комплекс (рис. 3). Определена характерная для этого вещества температура плавления >250 °C, а структура выпавшего кристаллического осадка достоверно подтверждена методом рентгеноструктурного анализа. Наличие в составе комплекса ионов цинка как комплексообразующего центра послужило основанием для использования тартратов в качестве прочных комплексообразующих лигандов.    Рис. 3. Результаты рентгеноструктурного анализа цинк-тартратного комплекса(ионы цинка показаны серым цветом)Results of X-ray structural analysis of zinc tartrate complex (zinc ions are shown in grey)  Для лечения заболеваний крупного рогатого скота применяется β-лактамный антибиотик IV поколения – цефтиофур гидрохлорид (рис. 4), содержащий β-лактамное кольцо, однако, как и другие препараты этого класса, он обладает характерным недостатком, т.к. до сегодняшнего дня не существует доступных ингибиторов металло-β-лактамаз (ИМБЛ) эффективно противодействующих формированию антимикробной резистентности за счет воздействия на металло-β-лактамазы (МБЛМ) микроорганизмов.    Рис. 4. Химическое строение антибиотика цефтиофура, содержащего в молекуле β-лактамный циклChemical structure of the antibiotic ceftiofur, which contains a β-lactam ring in its molecule  Результаты и их обсуждение. Цефтиофура гидрохлорид широко используется для лечения болезней копытец у крупного рогатого скота. В связи с этим для дальнейших исследований были подготовлены экспериментальные образцы с различными концентрациями и соотношениями этого антибиотика и ИМБЛМ при воздействии на смешанную культуру микроорганизмов вызывающие болезни копытец у коров. Результаты исследований представлены в таблице 1. Таблица 1Антимикробная активность разных соотношений антибиотика и ингибитора металло-β-лактамаз на смешанную культуру микроорганизмовAntimicrobial activity of different ratios of antibiotic and metallo-β-lactamase inhibitor on a mixed microbial culture Опытный образецСостав водных растворовЗона задержки роста, мм№1Цефтиофур 10 (мг/мл), тартрат 10 (мг/мл)20(контроль)Цефтиофур 10 (мг/мл)14№2Цефтиофур 10 (мг/мл), ЭДТА 10 (мг/мл)16(контроль)Цефтиофур 10 (мг/мл)9№3Цефтиофур 10 (мг/мл),золедроновая кислота 1 (мг/мл)21(контроль)Цефтиофур 10 (мг/мл)13  Результаты исследований (табл. 1, рис. 5, 6) свидетельствуют, что исследуемые ингибиторы, такие как: тартраты, хелатирующий агент – этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) и бисфосфониевая кислота с радикально замещенными группами (золедроновая кислота) снижают резистентность к данному антибиотику смешанной культуры микроорганизмов (Escherichia coli, Clostridium perfrinens, Streptococcus spp., Staphylococcus spp.). Наибольший выраженный антимикробный эффект был достигнут в опыте с ЭДТА (зона задержки роста – 16 мм, больше на 7 мм по сравнению с контролем 9 мм), меньший – в первом опыте (зона задержки роста – 20 мм при контроле 14 мм) – больше, чем у контрольного значения на 6 мм.Графическое изображение зон задержки роста смешанной культуры микроорганизмов экспериментальными образцами (АБ + ИМБЛМ) представлены на рисунке 6.    Рис. 5. Определение чувствительности смешанной культуры к ИМБЛМдиско-диффузионным методомDetermination of the sensitivity of a mixed culture to IMBLM using the disk diffusion method   Рис. 6. Графическое изображение зон задержки роста, мм (желтые – контроль)Results of measuring delay zones, mm (yellow – control) В следующей серии опытов проведены исследования препаратов на основе амоксициллина с ИМБЛМ (рис. 7) в отношении Staphylococcus aureus. Известно, что амоксициллин проявляет активность против некоторых штаммов золотистого стафилококка, однако неэффективен в отношении метициллин-резистентных штаммов, поскольку последние выработали устойчивость ко всем β-лактамным антибиотикам, включая амоксициллин. Для повышения эффективности амоксициллина против стафилококков его часто комбинируют с клавулановой кислотой – ингибитором β-лактамаз (в частности, пенициллиназ), который защищает амоксициллин от ферментативного разрушения.    Рис. 7. Молекулярное строение амоксициллина с β-лактамным циклом в своей структуреChemical structure of the antibiotic amoxicillin, which contains a β-lactam ring in its molecule  Амоксициллин отмечается высокой эффективностью в отношении штаммов Staphylococcus spp., не продуцирующих пенициллиназу. В случае инфекций, вызванных резистентными штаммами, применяют антибиотики других классов, например цефалоспорины последнего поколения.В таблице 2 представлены результаты изучения антимикробной активности разных концентраций амоксициллина и его активности с ИМБЛМ.На рисунке 8 представлено графическое изображение значений зон задержки роста Staphylococcus aureus.   Таблица 2Антимикробная активность амоксициллина с ИМБЛМ в отношении Staphylococcus aureusAntimicrobial activity of amoxicillin with IMBLM against Staphylococcus aureus Опытный образецСостав водных растворовЗона задержки роста, мм№ 4Амоксициллин 10 (мг/мл), тартрат 10 (мг/мл)9КонтрольАмоксициллин 10 (мг/мл)12№ 5Амоксициллин 10 (мг/мл), ЭДТА 10 (мг/мл)15КонтрольАмоксициллин 10 (мг/мл)13№ 6Амоксициллин 10 (мг/мл), золедроновая кислота 1 (мг/мл)13,7КонтрольАмоксициллин 10 (мг/мл)13   Рис. 8. Графическое изображение значений зон задержки роста Staphylococcus aureus, мм (желтые – контроль)Graphic representation of the values of the growth inhibition zones of Staphylococcus aureus, mm (yellow – control) В случае использования ЭДТА в составе препарата на основе амоксициллина также наблюдается (рис. 8) максимальная активность с ингибированием и задержкой роста до 25 % в опытном образце № 5 (15 мм) по сравнению с контрольным значением (13 мм). Однако наличие фенольной группы в амоксициллине, видимо, способствует конкурирующей реакции его с молекулой тартрата в составе ИМБЛ с образованием молекулярного комплекса и без участия ионов цинка, поэтому наблюдается даже снижение эффективности действия антибиотика в составе № 4 (9 мм) по сравнению с контролем (12 мм). Меньшая задержка роста в опыте № 6 (13,7 мм, контроль 13 мм) с золедроновой кислотой.При тестировании антимикробной активности на культуре микрогриба Candida tropicalis были получены положительные результаты ингибирования только в составе комплексов с лигандом, имеющим большую молекулярную массу – ЭДТА. Для исследований in vitro также были приготовлены опытные образцы с различными соотношениями концентраций основного антибиотика и ИМБЛМ (табл. 3).На рисунке 9 представлены испытания проб с целью определения чувствительности микроорганизмов Candida tropicalis к антибактериальным препаратам диско-диффузным методом на агаре. На рисунке 10 – графическое изображение зоны угнетения роста Candida tropicalis антибиотиками с ИМБЛМ в процессе ингибирования. Таблица 3 Антимикробная активность антибиотика с ИМБЛМ в отношении Candida tropicalisAntimicrobial activity of an antibiotic with IMBLM against Candida tropicalis Опытный образецСостав водных растворовЗона задержки роста, мм№ 7Бензилпенициллин 20 (мг/мл), ЭДТА 30 (мг/мл)2КонтрольБензилпенициллин 20 (мг/мл)1№ 8Цефтиофур 10 (мг/мл), ЭДТА 10 (мг/мл)2КонтрольЦефтиофур 10 (мг/мл)1         Рис. 9. Испытания проб с целью определения чувствительности микроорганизмов Candida tropicalis к антибактериальным препаратам диско-диффузным методом на агареResults of testing samples to determine the susceptibility of Candida tropicalis microorganismsto antibacterial drugs using the disk diffusion method on agar  Рис. 10. Графическое изображение зоны угнетения роста Candida tropicalis антибиотикамис ИМБЛМ в процессе ингибирования, мм (желтые – контроль)Graphic representation of the zone of growth inhibition of Candida tropicalis by antibioticswith IMBLM during the inhibition process, mm (yellow – control) Выраженный антимикробный эффект был достигнут в опыте № 7 бензилпенициллина с ЭДТА (зона задержки роста – 2 мм, больше на 1 мм по сравнению с контролем), аналогичный в опыте № 8 цефтиофура с ЭДТА (зона задержки роста – 2 мм при контроле 1 мм).Таким образом, все опытные образцы с расчетным содержанием ИМБЛ на основе бензилпенициллина, амоксициллина и цефтиофура проявили антимикробную активность в отношении микроорганизмов (Escherichia coli, Clostridium perfrinens, Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Candida tropicalis). Наиболее выраженная антимикробная и антирезистентная активность отмечалась при использовании цефтиофура и амоксициллина при добавлении хелатирующего агента – ЭДТА: в опытах № 2 и 3 антибиотическая активность усиливалась почти вдвое. В случае применения амоксициллина выраженный эффект проявлялся при использовании в качестве ИМБЛМ золедроновой кислоты, однако при использовании тартрата отмечается обратный эффект, что, возможно, связано с наличием у него конкурирующей реакции с имеющейся в химической структуре антибиотика открытой, легко доступной фенольной группы. В связи с этим необходимо исключать тартрат из состава потенциальных ИМБЛМ в случае использования амоксициллина (а также любых АБ, имеющих свободную фенольную группу в составе молекулы).Заключение. Полученные данные позволяют сделать вывод, что хелатирующие агенты с высокой молекулярной массой, в частности подобные ЭДТА, обладают ингибирующим действием на смешанную культуру микроорганизмов, штаммы Staphylococcus aureus и даже чрезвычайно устойчивые к воздействию антибиотиков дрожжевые микроскопические грибы (Candida tropicalis). Результаты и выводы позволят разработать новые рецептуры препаратов с использованием ИМБЛМ.Авторы выражают признательность коллегам за помощь в проведении исследований.